Ⅰ mNGS检测呼吸道病原体
文献信息:
文献:Metagenomic Sequencing Detects Respiratory Pathogens in Hematopoietic Cellular Transplant Patients
中文:宏基因组测序检测造血细胞移植患者的呼吸衡巧道病原体
杂志:American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. IF:13.204
时间:2017年7月
单位:加利福尼亚大学
摘要:
下呼吸道感染是造血细胞移植(HCT)接受者住院和死亡的主要原因。尽管如此,由于传统诊断法在预防性抗菌剂的设置中产量降低,抗体滴度降低,以及来自罕见机会微生物的感染,病因往往无法确定。mNGS可能提供更强的诊断,通过进行无需培养临床样本的微生物组成的综合检测。通过捕捉微生物和人类RNA, mNGS还允许同时通过转录组分析宿主免疫反应, 可以提供快速(< 48 h)和可行的微生物咐指键学的数据精确传染病诊断。
1 样本、常规临检:
由于HCT受者明显需要加强LRTI诊断,我们根据密歇根大学HUM00043287协议,先后纳入了22名因急性呼吸系统疾病住院的成人HCT受者,他们在2012年1月25日至2013年5月20日期间接受了支气管镜检查和BAL检查。对所有患者进行标准护理 BAL微生物学检测 ,包括 细菌、分枝杆菌、真菌和巨细胞病毒的半定量培养;曲霉半乳甘露聚糖检测;jirovecii肺孢子虫银染色;流感A/B、呼吸道合胞病毒和人偏肺病毒;和人疱疹病毒-6聚合酶链反应 ,具体方法见在线补充(4)。对血液和鼻咽部样本的补充诊断由治疗医师自行决定,具体见表1和在线补充(4)。
2 建库、测序、分析:
用250 μl BAL构建RNA和DNA测序文库,并根据已建立的方法进行双端Illumina测序。病原体检测利用定制的生物信息学管道来区分临床样本中逗郑的病原体和背景微生物污染物(参考2,3)。使用由每百万读序列(rpM)排列的核苷酸reads乘以每个属相对于无模板对照的nt和nr Z-scores之和所组成的排序分数[score = rpMnt×(Znt + Znr)]。
参考2: Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med 2014
参考3: Illuminating uveitis: metagenomic deep sequencing identifies common and rare pathogens. Genome Med 2016
方法:sequence-based ultra-rapid pathogen identification (SURPI)
3 评估标准
微生物鉴定被归类为病原体确认,如果:1)临床试验和mNGS发现了微生物, 2) 存在致病性在肺部的文献证据, 和3) 得分至少两倍比其他相同类型的微生物(病毒、细菌或真菌)中确定病人。如果mNGS单独识别了微生物,且符合标准2和3,则认为微生物是新的潜在病原体;所有其他微生物都被认为是不太可能或不确定的病原体。结果分别由病毒PCR或细菌16S rRNA基因测序独立证实,如(参考4)所述。
4 结论:
总而言之,我们利用元基因组测序的持续改进来扩大LRTI诊断急性呼吸系统疾病HCT受者的能力。我们证明,与目前的微生物诊断相比,mNGS具有更大的检测微生物的能力,并且能够将病原体检测与宿主反应和气道微生物组同步分析相结合。
参考:
临床上那些潜藏的病原体,可以用宏基因组测序“揪出”吗?
Ⅱ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些
病原微生物种类繁多,变异迅速,快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进著。目前,应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因晶片、多聚酶链反应等,该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物,又称病原体,有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病,也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强,往往造成世界性大流行,因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐,检测周期长,而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展,病原学诊断已不再局限于病原体水平,深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因晶片技术等检测方法,自动化程度高,快速省时、无污染、结果精确,可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主,将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1.1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小,大多无色半透明状,将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速,对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用,例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和装置,在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1.2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间,检测周期较长,不能同时处理批量样本。为解决这一问题,各种自动化培养和鉴定系统不断产生,传统鉴定方法也在逐步改进,大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪,可同时做细菌鉴定和药敏试验,检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高,常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基,大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌,生长指数明显高于血平板。1.3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体,包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的,将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养,再将病原体接种于相应的组织细胞中后,病原体可在其中繁殖增长,引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内,引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术,简化了鉴定步骤,常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性,不仅可检测样本中病原体抗原,也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50% ~80% ,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染,其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高,ELISA应用於乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起,如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上,通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物,在外部磁场磁力的作用下,将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠,如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等,广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测,检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌,免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g~;IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测,肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS.PCR检测
目前主要普通培养(简称标)般报告要用仪器、核酸检测(PCR)、目前快速检测(主要包括:免疫磁珠、酶联免疫试剂盒、金标检测卡等根据自需求选择
目前主要有普通培养法(简称国标方法)一般出报告的要用,仪器法、核酸检测法(PCR)、还有目前的快速检测法(主要包括:免疫磁珠、酶联免疫试剂盒、金标检测卡等。这个根据自己的需求来选择吧。
简述hiv的微生物学检测方法有哪些
梅毒是由苍白螺旋体感染引起的一种性传播性疾病 。梅毒螺旋体感染人体后出现两种抗体:一种是特异性抗体(TPHA),为lgM。当有补体存在和厌氧条件下,对活螺旋体的动力有抑制作用,并可将螺旋体杀死或溶解,对机体的再感染有保护作用。另一类是非特异性抗体(快速血浆反应素 RPR)。为lgA与lgM的混合物,可与正常生物组织中的类脂抗原发生非特异性结合,对人体无保护作用
传统检测有三种方法
1、直接显微镜观察,正常情况,在一定的培养条件下(相同的培养基、温度以及培养时间),同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。
2、选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件,选择培养基,其作用是允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用型别或某一特征进行间接判断,得到的微生物往往并不只有一种,但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。
3、鉴别培养基,根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比,鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小,一般可直接测定某微生物的种类。
现代定义
微生物:个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。
微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。(但有些微生物是肉眼可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝等。)病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”,但是它的生存必须依赖于活细胞。
根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等,按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。
主要特征
1、体小面大
2、吸多转快
3、生长繁殖快
微生物的这一特性使其在工业上有广泛的应用,如发酵、单细胞蛋白等。微生物是人类不可或缺的好朋友。
这个是我在网上找到的的微生物的检测试纸片,也不知道方法咋样,你要也可以去网站上看看的
像大肠杆菌测试纸片 肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种新出现的食物传播性疾病的病因。它除了引起腹泻、出血性肠炎外,还可发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发症。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来,肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延,相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻爆发和流行。我国已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到大肠杆菌O157:H7。大肠杆菌O157测试片(FilmplateTM E.coli O157BO204)3方元方圆生物的采用进口高选择性显色培养基作为主要原料,运用专有技术,做成一次性快速检验产品,一步培养15~24h就可确认,大大地简化了检测程式,非常适合各级检验部门和食品企业使用。本品适用于海产品、水产品、各类熟肉制品和冷荤、蛋及蛋制品等的快速检测。参照标准:食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验(GB/T4789.36)。
; 用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面取25cm2的面积,在其内涂抹10次,然后剪去手接触部分棉棒,将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的取样管内送检。擦拭时棉签要随时转动,保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具 *** 置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间
先配制固体培养基,再划线培养1天,之后挑每一种菌落的细菌制片,显微镜下观察细菌的种类
Ⅲ 鉴定未知病原体的技术有哪些
鉴定未知病原体的技术可以用快速测试片技术法,具体介绍如下:
快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中好拆弊友族微生物的方法。
细菌总数检测纸片的研制始于20世纪80年代,其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的Petrifilm为载体的测试片已开始被广泛应用。
每个人一生中可能受到150种以上的病原体感染,在人体免疫功能正常的条件下并不引起疾病,有些甚至对人体有益,如肠道菌群(大肠杆菌等)可以合成多种维生素。御枝
Ⅳ 食源性致病菌的快速检测方法有哪些
检测致病菌大概有如下几种方法。
1 传统生物学方法,按照标准检测,最麻烦,最传统,但是最经典,可作为其他方法之验证。
2 显色培养基方法,用国外进口显色培养基检测,比较方便,目前最流行,使用简单,也不贵。
3 胶体金试纸条检测,购买国外进口试纸条,现场检测,这种方法10分钟可以检测到结果。但是检测灵敏度偏低。
4 ELISA,酶联免疫实验。目前只有国外进口枝态,欧美四家大公司垄断了全球95%以上的市场,一个96孔试剂盒,售价高达5000-6000元,非常无奈,但是是国外最流行的快速筛选技术,检测灵敏度、检测周期都比较理想,不过国内现在有公司专业在做这方面的试剂盒了,估计价格很快会降下来,可能是将来主流的检测技术了,部分已经写进国标了。
5 IC-PCR,免疫捕捉PCR,用抗体特异性识别捕捉,之后再PCR扩增。最大的优势是,病原经过抗体识别、PCR检测双重检测,可一次鉴定到种,检测灵敏度可以达到十的两次方,不用核酸提取,所有反应在一个PCR管里进行,减少了病原的损失,缺点是检测时间大致在4个小时,是一张理想的验证手段。
6 Direct-PCR,增菌后直接PCR,比较简单的验证手段,增菌后直接扩增,受PCR检测体系的现实,灵敏度偏低,但是取决于样品中的菌含量。
7 Nested-PCR,两对引物巢式PCR。两对引物两次扩增,最大的优势是检测准确性、灵敏度可绝对保障,劣势是检测时间较长。
8膜过滤PCR,利用病原富集装置,富集之后检测,最笨的一种方法,但是是最实用的,病原经过微孔滤膜过滤后,可高效富集病原 ,之后去检测,大大提高检测灵敏度。
9 BIO-PCR,培养增菌后PCR扩增,这个技术只能做研究用了,就是分离培养后,用PCR检测,乏善可陈。
10 IMS-PCR,免疫磁珠PCR,用免疫磁珠捕捉,之后进行PCR,用磁珠富集样品中的病原,之后直接PCR扩增,非常实用的方法,主要是可以富集病原。
11 BAX快速检测系统,按照系统说明书操作。贵族实验室用的东西,灵敏度瞎搭仔和其成本、假阳性一样出色。
12 RiboPrinter快速检测系统磨汪,按照系统说明书操作。同上,大同小异。
Ⅳ 请学生物的同学帮忙介绍一下“PCR”
PCR
一、PCR概述
1、什么是PCR
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE(Perkin Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
2、PCR技术发展史
PCR原理是由一对引物介导,能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增,经过n个热循环扩增,扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0<E<1,扩增效率=倍,使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品:
第一代:手动/机械手式水浴基因扩增
如上图所示,用三个恒温水浴箱,分别将三个水浴温度恒定在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)低温复性温度(如58℃),适温延伸温度(如72℃)。再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴,标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环:
94℃ 30S 58℃ 45S 72℃ 60S
40次循环
这种方法的特点是:实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起差错;而优点是:设备简单,投资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反应条件,事实表明实验效果还是不错的,但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中,因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰,影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶(某些PCR反应需要多于三个温阶)、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。
为改进提高本方法的自动化水平,有人设计了机械手装置,替代上述手工移动标本过程,形成了机械手水浴式基因扩增仪,该改进解决了实验人员的高强度劳动问题,但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售,应用也较广,曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献,而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代,现在很少有单位使用。
第二代:自动化控制型定性基因扩增仪
与上述水浴式扩增仪相比,也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪,它是最具代表性的扩增仪,包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。
第三代:终点定量/半定量
第二代的定性PCR只能判断阴性阳性,而无法评价特定核酸的浓度及定量分析,定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能:
•潜伏期病毒浓度探测
•感染程度
•致病病原体数量变化测定
•抗病毒药物疗效评估
•恢复期病毒载量检测
自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来,PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少,对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构,利用现有的第二代常规定性PCR仪,在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作,起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品,而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少,国产仪器较多,如西安天隆的TL988,上海棱光的DA620型等
第四代:实时定量PCR
实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
见下图:(略)
2、实时荧光定量PCR的优势:
设备由荧光定量系统和计算机组成,用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平,这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值(限制点的循环数)。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大,这样可以获得最准确,可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度。
3、实时荧光定量PCR技术原理
所谓real-time Q-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。
4、实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用
⑴ 病原体检测:目前,采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
如:结核菌基因诊断的意义主要表现在:
a.区分TB与其它分枝杆菌;
b.检测TB耐药基因;
c.提高TB的阳性检出率。
⑵ 产前诊断:到目前为止,人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,只能通过产前监测,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生,如为减少X连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法,易为孕妇所接受。
⑶ 药物疗效考核:对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示:病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达,干扰素治疗作用不敏感,而HCV低滴度,干扰素作用敏感;在拉米夫定治疗过程中,HBV-DNA的血清含量曾有下降,随后若再度上升或超出以前水平,则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的应用及意义:
a.了解乙肝病毒在体内存在的数量。
b.是否复制。
c.是否传染,传染性有多强。
d.是否有必要服药。
e.肝功能异常改变是否由病毒引起。
f.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。
g.判断药物治疗的疗效。
⑷ 肿瘤基因检测:尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现,荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
(5)在优生优育中的应用:
近年来经济发展迅猛,人民生活水平逐年提高,对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外,由于国内计划生育工作逐步走向深化,独生子女比较多,孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此,怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质,即优生优育已显得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②增进体力、智力优秀个体的繁衍。其中避免有严重遗传性疾病及先天性疾病个体出生是优生优育最基本的内容。从临床优生学角度分析具体工作包括在母亲妊娠期间对母亲及胎儿进行遗传学检查尽量排除常见的遗传性疾病个体的出生,另外在妊娠期检查母亲是否患有某些易引起胎儿畸形的传染性疾病如弓型虫、风疹病毒、衣原体等感染。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法,而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病,染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析(sscp)、限制性片段长度多态性分析(RFCP)等位基因特异性寡核某酸(Aso)点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上,因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸形的感染性疾病原体主要有单疱病毒(HSVⅡ)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)、弓形体(TOX)及沙眼衣原体(CT)。以往这些病原体感染诊断比较困难,主要靠培养法进行确诊,而培养法费时,代价昂贵,而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响,基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪,是最值得推荐的检验方法。
1、PCR基因扩增法在遗传性疾病产前诊断中的应用,遗传病是由于遗传物变化而引起的机体某一功能或缺陷或异常所致的疾病,其根本变化在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病,染色体遗传病及多基因遗传病。遗传病诊断除询问病史,一般物理诊断,普通实验室检查及了解症状、体征外有特殊性。过去常应用系谱分析,染色体及性染色色质检验作为遗传病诊断的主要依据,再辅以相关的酶学分析从而作出诊断。随着分子生物不的迅速发展及其在遗传性病诊断中的广泛应用,基因诊断技术诞生,基因诊断技术为遗传病的临床诊断起了很大的促进作用。聚合酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一。这种快速、灵敏的基因体外扩增技术与多种分子生物学手段相配合可以检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等,PCR技术日益成为遗传病诊断的最有效、最可靠的方法之一。以下举几个在国内有普遍意义的例子。
(一)、PCR检测地中海贫血;地中海贫血(Thalassemia)是一种遗传性慢性溶血性贫血病,是世界上最常见且发病北最高的一种单基因遗传病。在两广、贵州、四川等地发病率较高,在广西等地高达15%。地中海贫血是由于基因突变造成珠蛋白的不平衡,使结构正常的肽链合成量减少甚至没有合成表现为溶血性贫血。接受累基因种类分为α、β、γ等,其中以 α、β地贫为最常见,危害了最大。珠蛋白基因簇位于人6号染色短臂上,有两个重复基因基因位于α1、α2、两个α基因及其旁侧序列有很大的同源性,易出现染色体不等交换,导致α基因缺失-α地贫。α地贫基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同时缺失及非缺失型地贫。可以应用PCR技术扩增α1、α2基因从而检测这些基因是否缺失、突变等,从而对α型地中海贫血作出诊断。β地中海贫血基因缺陷主要表现为基因序列中单一核苷酸的突变,或少数碱基的缺失、插入,使正常β珠蛋白肽链合成减注或缺失。应用位点特异性寡核苷探针(Aso)进行PCR产物斑点杂交即可对其作出诊断。
(二)、苯丙酮尿症,苯西酮尿证(PKU)是一种常染色体隐性遗传病,患者因苯丙酸羟化酶转化为酷氨酸,使苯氨酸及其代谢物在体内大量蓄积,出现脑组损伤及不可逆性智力发育障碍。PKU患者出生时正常,新生儿一经确诊为PKU停止母乳喂养采用低苯丙氨酸钦食疗法8—10年,可使患者智力水平发展维持正常。由于低苯丙氨酸钦食非常昂贵,一般家庭难以承受,因此,施行产前诊断,防止患儿出生是最好的选择。PAH只在肝细胞中表达,不能用血细胞,成纤维细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性分析,只能进行基因诊断。PKU的基因变化并非全部PAH基因的缺失,而是以点突变为主要表现形式,而且其突变位点很多。必须使用PCR扩增结合,ASO,SSCP或使用扩增片段长度多态性分析(AmpFLA)进行检测,这些技术都较复杂,检验人员须经专业培训。
(三)、血友病,血友病是一组最为常见的遗传性凝血障碍,根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型,(Ⅷ、Ⅸ因子缺陷),也有复合型血友病,但不常见。甲型血友病发病率为1/10000,Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近,全长186Kb,大范围的基因重排(缺失、插入、重复)导致甲型血友病的病例很少,仅为Ⅷ因子缺陷的5%,大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb,突变位点多,而且新生突变频率高,从临床角度讲不能对每一个突变都检测,可对最为常见的几种突变类型进行检测,主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%,其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。
(四)、性别发育异常,区别雄性及雌性的物质基础是性染色体,哺乳动物胚胎发育中,雌性表型不需要任何调节,而雄性表型则由多因素决定,位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子(TDF)。现代研究表明,SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因是TDF基因,位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失,从而诊断性别发育异常,这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化,这是用于雄激素受体(androgen receptor,AR)基因缺欠,使雄激素的靶基因对雄激素不应答就答或不全而引起的,根据病情的不同有不同的表型,AR缺陷有很高的新生突变频率,表现为无家族史的散发病。AR基因长90Kb,位于X染色体上,AR基因异常大部分为个别基因碱基的突变,可以通过PCR结合ASO或SSCP检出。
(五)、脆—X综合征,脆—X综合片(fragile-X Syndrome,Frax)是发病率最高的一种X-连锁的智力低下综合征(X-linked mental retardation XLMR)。因这种综合征与X染色体上的脆位点连锁而得名。大多数FRAX男性智商(IQ)低于50,并有随着年龄增长而下降的趋势。用人工酵母染色体(artificial yeast chromosome,YAC)克隆技术分离获得覆盖X-脆位点区域的YAC克隆,在这一克隆中获得一个能在人脑中表达的基因命名为FMR-1(fragile X mentai retardation-1),FMR-1的5‘端有一个CGG(精)三核苷酸串(CGG)n,正常人群中(CGG)n中存在多态性,重复序列为6-46个,当重复超过52个时,此区域的分裂呈不稳定,导致重复序列大幅度增加,无临床表现的携带者插入片段长度小于500bg,有临床表现者,长度都大于600BP而且伴有甲基化。人们将500bp作为前突变与全突变的分界线。对Frax的诊断以前用细胞遗传学的方法检测脆位点,实验条件严格,成功率不高。现在采用分子遗传学方法即可诊出前突变及全突变。用PCR扩增CGG重复序列,检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段增大,体细胞异质性时出现多条长度不等的扩增带甚至拖尾成一片,或者因为扩充的全突变插入片段过长超出PCR扩增能力而结果无扩增现象。
2、PCR基因扩增法在“Torsch”诊断中的应用,在妊娠早期(1-3个月),有些病原微生物的感染易导致胎儿畸形,这些病原体中最常见的有弓体(TOX)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)、沙眼衣原体(CT)、及巨细胞(HCMV),对这几种病原体的检测根据其英文词首简称为Torsch试验。
(一)、弓形体的PCR检测,弓形体有广泛的自然疫原性,人体多为隐性感染,抵抗力低时可以有临床表现。弓形体的诊断较困难,血清学方法敏感性较高但有交叉性出现假阳性而且无法确定近期感染、远期感染或一过性感染。确诊的方法是活组织检查或动物接各,这些方法阳性率太低不能推广。PCR检测可以检出样本中1-2个病原体而且准确性高,是目前对弓形体检测最优秀的方法。作为优生优育检查应于妊娠前或妊娠早期取全血样本,可以用EDTA或肝素抗凝,以EDTA抗凝效果最好,检测外周血白细胞中是否有TOX存在。对于不孕,多次自然流产或养小动物的产期妇女,作弓形虫检测有更重要的临床意义。
(二)、风疹病毒感染:风疹病毒(RV)是一种单股正极性RNA病毒,人是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎儿的畸形,影响胎儿免疫系统的发育,因此RV检测在优生优育工作中显得非常重要。RV检测可以用直接培养法及IgM抗体测试法。培养法费时很长而且常受到其它病毒的干扰,IgM测定法结果了不太准确,PCR法敏感性及特异性都很高而且简便快速,是RV感染最优秀的测试方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道增殖而出现症状,面部出现丘疹,迅速遍及全身。样本采用妊娠母亲的咽部拭子、血清、产妇的绒毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒,PCR扩增较复杂,应注意样本的采集时机,操作的准确性。
(三)、单纯疱诊病毒,单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是一种DNA病毒,可引起多器官的炎症,可通过性接触传播。HSVⅡ感染复发率高,80%的感染者于12个月内复发。HSV感染后经机体免疫系统清除,少数病人终生携带,体弱时复发。PCR法检测HSV敏感性高而且可以直接对HSVⅠ/Ⅱ型进行分型鉴定。
(四)、沙眼衣原体,沙眼衣原体(CT)不仅能引起沙眼而且能引起生死器感染,是一种性传播性疾病。与淋病(NG),梅毒等经典性传播性疾病不同,CT易经其它接触途径传播,少数地区对妊娠期妇女普查结果表明此人群中发病率高达20%-30%。在欧美等国家CT的感染已超过淋病而居性传播性疾病之首。衣原体感染常呈无症性或非特异性症状的隐性感染,不容易诊断。以往用培养法进行确诊,费时且敏感性、准确性都不足。PCR用于CT检测时应注意不同检测目的的取材不同,对于性传播性疾病诊断应取生殖道分泌物(查脱落细胞),而对于早期妊娠病人应查其全血样本,在妊娠后期或临产时再查阴道分泌物以便指导生育时产道清理。
(五)、人巨细胞(HCMV),HCMV感染十分普遍,除少数原发性感染发生原发性单核细胞增多症外,极大多数为隐性感染。HCMV可以长期潜伏在体内,当机体免疫功能低下时,病毒会激活而造成严重疾病在妊娠期如果孕妇感染HCMV可以引起早产、畸形、死胎及新生儿巨细胞包涵体病等。HCMV属疱疹病毒科,可以从唾液、尿、宫颈分泌物及乳汁排出。HCMV“金标准”的诊断试验是用单层成纤维细胞作病毒培养,其它的实验检查有血清学的检测及包涵体检测。PCR是HCMV检测的一种新方法,用于检测的样本有血,生殖道分泌物拭子等,用于优生优育检测时应取血样本。对于早期妊娠病人若有HCMV感染应再检测羊水,或其它妊娠物,对病人认真及进跟踪检查,综合判断并采取相应的医疗措施。
PCR应用于优生优育有很大的优越性,使这一技术的推广应用刚刚起步,应注意操作的准确性,尽量避免误诊。对感染性疾病首先应取孕妇血样检测,有可疑时或血中检出病原体核酸时应尽早作羊水等妊娠物检查。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险,对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。
5、实时荧光定量PCR技术在研究方面的部分应用
一、 新药开发研究,人用药物及其他药物
针对一些感染性疾病的药物,如各种病毒病、细菌病等,在新药的开发过程中,快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金,与以前所用的Elisa等方法相比,实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,因此有利用分析药物的作用效果,为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。
此方法除了用于人用药物以外,还可以用于畜用药物,甚至其他经济动物及植物的药物研究等,因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。
二、 超早期感染用药物及疗法的研究与开发
实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量,因此不必等到病人体内产生抗体,同时,由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语,在病毒感染的早期,即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域,即在病毒或细菌含量很低时如何用药,用什么药以及用药量等进行研究,为将疾病消灭在超早期作出贡献。
三、 药物疗效研究,人用药物及其他药物
对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药,其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究,为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量,灵敏度也不够,因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多,意义也很大。
四、 新的愈后指标的研究
对于感染性疾病,在药物作用至一定程度后,就认为可以停药了,但是应该在什么停药,现在大都没有一个明确的指标,现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制,这一指标未必合理,因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究,从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
五、 新诊断及检验试剂的开发
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等,而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点,从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂,从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等;这类试剂的种类是非常多的,所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。
六、 血液检验漏检率
由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多,因此,血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率,即分析Elisa方法测定为阴性的血样,再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时,一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV,后经测定供血者,证实病人的确是HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测定北京血站中5万份Elisa阴性血样的漏检率。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同,因此不同地区都有必要进行这一工作。
由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点,其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的,如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等;研究人员也可以根据自己研究项目开发其新的用途。
二、TL988实时荧光定量PCR检测系统产品介绍
1、如何选择一款适合自己的PCR仪
回顾分子生物学的发展历程,PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中,最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃,通过对PCR过程的实时监控,专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度,已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手,详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术,为定量PCR仪的选择提供详细参考。
定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键--由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统,多色多通道检测是当今的主流趋势--仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。--随着定量PCR技术在临床诊断、疾病
Ⅵ 人类历史上对致病微生物的无知而遭受传染病大流行的事例有哪些
黑死病
14世纪,鼠疫大流行,当时被称为“黑死病”,流行于整个亚洲、欧洲和非洲北部,中国也有流行。在欧洲,黑死病猖獗了3个世纪,夺去了2500万余人的生命。引起瘟疫的病菌是由藏在黑鼠皮毛内的蚤携带来的。在14世纪,黑鼠的数量很多。一旦该病发生,便会迅速扩散。因黑死病死去的人很多,以至劳动力食缺。整个村庄被废弃,农田荒鞠,粮食生产下降。紧随着黑死病而来的便是欧洲许多地区发生了饥荒。劳动力匮乏经济遭受重创。
谁知道欧洲黑死病的详细历史?
欧洲黑死病的病因、耐携宏具体事例以及治疗方法
黑死病是怎样一种病啊?
肆虐欧洲的黑死病怎么消失的?
鼠疫、黑死病能治疗吗?
是谁发现了能治疗黑死病的人?
西班牙流感
西班牙大流感所造成的灾难是流感流行史上最严重的一次,也是历史上死亡人数最多的一次瘟疫,估计全世界患病人数在7亿以上,发病率约20%~40%,死亡人数达4000-5000多万。美国科学家的研究显示,1918-1919年导致5000万人死亡的西班牙流感病毒很可能源自鸟类。实际上是禽流感的变异。和黑死病类似,流感期间,交通、饭店、零售、隐樱旅游和娱乐业不景气,医院和健康服务成了最大的赢家。值得一提的是,通讯业得到了良好的发展。
1918年西班牙大流感对日常生活的影响
历史上的高死亡率的疾病西班牙大流感
人类都经历过哪些灾害性疾病的洗礼?
欧洲曾经有次瘟疫死了一半的人,能介绍下详细情况吗?
为何要设立洗手日
西班牙大流感——有因为感冒而死的人吗?
疯牛病
主发国在英国。据估计死亡人数以每年30%左右的速度逐年上升,迄今为止死于此疫的人数为69人。波及至法国、爱尔兰、加拿大、丹麦、葡萄牙、瑞士、阿曼、德国,波兰、捷克、匈牙利、斯洛伐克、阿尔巴尼亚、爱沙尼亚、立陶宛和塞普勒斯等。据美国有线新闻网估计,疯牛病事件将给美国造成了至少数十亿美元的经济损失。
疯牛病如何防治?
如果人得了疯牛病会传染给和他接触的人吗
感染疯牛病病毒的牛肉不能食用是因为什么原因
为什么人吃了疯牛病的肉也会得疯牛病呢?
有关疯牛病对英国造成的灾害
疯牛病的“元凶”体内无哪种物质仅有哪种物质?
口蹄疫
2001年,英国暴发口蹄疫,集中宰杀、焚烧了近700万头感染口蹄疫的牲畜,许多农民损失惨重。世界上大多数的国家如美国、加拿大、日本、南韩、澳洲、纽西兰及一些欧洲国家等;东南亚各国、中国香港、中国大陆等皆属”口蹄疫疫区”。口蹄疫使英国当年的经济增长速度由原先预测的2.3%降至2%,造成的经济损失达到70亿英镑。支柱产业之一旅游业受到重创。据报道,与2000年同期相比,仅英国乡村地区的旅游收入就减少了75%。
手足口病就是口蹄疫么?
牲畜口蹄疫昌册如合防治?
猪口蹄疫有什么药吃
有没有气温上了30度口蹄疫病毒就会死的说法?
巴氏消毒能不能杀死口蹄疫病毒
猪痘病、水疱病与口蹄疫怎么治疗
SARS
2003年,我国内地24个省区市先后发生非典型肺炎疫情,共波及266个县和市(区)。截止8月16日10时,我国内地累计报告非典型肺炎临床诊断病例5327例,治愈出院4959例,死亡349例。2003年旅游收入减少约1200亿元,影响全年GDP少增长1.1个百分点。餐饮业零售额减少约315亿元,影响GDP少增长0.3个百分点。对其它消费品的整体影响较小,在200亿元左右,影响GDP少增长0.2个百分点。外贸净出口比2002年减少约70亿美元。
sars死亡人数?
SARS不在海南流行的原因?
SARS的病毒到底是怎样的病毒?
猪流感、禽流感和SARS有什么异同?
SARS病毒是怎样感染人的
SARS是病名还是病毒名
禽流感
到目前为止全球共有15个国家和地区的393人感染,其中248人死亡,死亡率63%。中国从03年至今有31人感染禽流感,其中21人死亡。2004年初禽流感席卷美国和亚洲部分国家,中国、日本、越南等国上百万家禽染病死亡,多人可能因感染禽流感病毒而去世。截止到2005年,禽流感已造成全球超过1.5亿只禽类被扑杀,63人死亡,直接经济损失高达100亿美元。范围波及至农业、旅游业等行业。世行预言禽流感将造成全球经济损失达8千亿美元。
什么是禽流感?
禽流感起源于哪个国家?
禽流感传播途径
禽流感的症状
关于禽流感艾滋病非典的资料有哪些?
禽流感的死亡纪录
猪流感
主发于墨西哥,确认及疑似猪流感死亡人数升至152人;全国疑似病例高达4000余人。美国确诊病例上升至50人,此外还波及至加拿大,英国,法国,德国,韩国,纽西兰,澳大利亚,义大利等19个国家。世界银行预测全球将会因此损失3万亿美元,经济复苏会遭受重大影响。猪流感极有可能存在两种方式传播,即猪传染给人,人与人之间进一步传播。
人感染“猪流感病毒”后什么症状?怎么预防和治疗?
正确面对“猪流感”不必惊慌
猪流感会影响到餐饮业吗
抗病毒口服液能预防猪流感吗?
猪流感会影响猪的市场价格吗?
猪流感有哪些传播途径?如何预防?
望采纳。
1、鼠疫(plague) 是由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病, 也叫做黑死病。是细菌,原核生物。
2、水痘(chickenpox, varicella) 是由水痘-带状疱疹病毒 (varicella-zoster virus, VZV)初次感染引起的急性传染病
3、天花(Smallpox)是由天花病毒引起的一种烈性传染病,也是到目前为止,在世界范围被人类消灭的第一个传染病
4、疯牛病
牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy,简称BSE),俗称疯牛病(mad cow disease),是由传染因子引起的牛的一种进行性神经系统的传染性疾病,是一种传染性海绵状脑病。该病的主要特征是牛脑发生海绵状病变,并伴随大脑功能退化,临床表现为神经错乱、运动失调、痴呆和死亡。
病原不确定,医学界意见不一致,也没有证明。
5、口蹄疫
由口蹄疫病毒(FMDV)所致急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽,以发热、口腔黏膜及蹄部和 *** 皮肤发生水泡和溃烂为特征,是国际兽疫局规定的A类传染病,易通过空气传播,传染性强,流行迅速,偶尔感染人,主要发生在与患畜密切接触的人员,多为亚临床感染。
6、疟疾
寄生于人体的疟原虫有4种,即间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。疟原虫在红细胞中增殖成裂殖子,使红细胞胀大破裂时,大量的裂殖子和疟原虫代谢产物进入血流,引起异性蛋白反应,机体肌肉收缩产热,网状内皮系统吞噬细胞功能增强,故可引起肝、脾肿大,多次发作可致贫血等。疟原虫在红细胞内增殖成熟所需时间不同,间日疟和卵形疟为48小时,三日疟为72小时,恶性疟为24~48小时,故临床上出现周期性发作。疟原虫属是一类单细胞、寄生性的原核动物。
7、大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌,原核生物。
8、绿脓杆菌广泛存在于自然界,是伤口感染较常见的一种细菌,原核生物。
一般带什么杆菌的都是细菌。病毒是微生物,没有细胞结构,既不是原核,也不是真核。
9、黑死病、鼠疫、天花、流感以前称为四大瘟疫,现在不是了。
从我们环境工程学角度来讲,污水中含有细菌总数与水污染状况有一定的关系,与治病程度也有一定关系,但是不能直接说明是否有病原微生物存在。粪便污染指示菌一般是指如有该指示菌存在于水体中,即表示水体曾有过粪便污染,也就有可能(注意,这里是“可能”)存在肠道病原微生物。那么该水质在卫生学上是不安全的,但是对人的影响还是因人而异的。
常用的指示菌或其它指示微生物有:总大肠菌群、粪大肠菌群、粪链球菌、产气荚膜梭菌、双歧杆菌属、肠道病毒、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌属、志贺氏菌属、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属、副溶血弧菌等。此外,还有水生的真菌、放线菌和线虫。——这是地表水和自来水水质评价的一些有害病菌的指标,污水同样适用。毕竟自来水更关注于人的健康疾病之类的方面。微生物种类和名称非常多,上述基本上就是主要的了,都列举上估计都快可以出书了。这估计也不是一两句话能讲清楚的。需要环境学、医学、卫生疾病学共同来给你解答了。
需要注意的是,上段中我这里说的是指示性微生物,也就是说,有这些微生物存在的时候治病的概率非常大,但是不能说这些微生物就是一定能诱发人体患病的根源,这取决于人体自身免疫力和微生物数量等一些列复杂因素。
传染病由病原体引起的,能在人与人之间或人与动物之间传播的疾病叫传染病。病原体包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等。传染病具有传染性和流行性等特点。
传染病流行的基本环节:
传染病能够在人群中流行,必须同时具备三个基本环节:传染源、传播途径、易感人群,如果缺少其中任何一个环节,传染病就不能流行。
(1)传染源:能够散播病原体的人或动物。
(2)传播途径:病原体离开传染源到达健康人所经过的途径。主要有空气传播、唾液传播、水传播、饮食传播、生物媒介传播、接触传播等。
(3)易感人群:对某种传染病缺乏免疫力而容易感染该病的人群
温度
营养物质
ph
空气(厌氧除外)
防毒剂
可以从微生物的结构等等考虑
1、呼吸作用提供能量——————需要氧气、营养物质
2、微生物的体内都有蛋白质---------------能使蛋白质变性的夜都符合条件,比如酒精、福尔马林
3、……都有酶-------------------------------能使酶失活的夜可以,比如ph,温度
4、微生物比如细菌,有细胞壁,所以影响到其细胞壁合成的就不行
白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌(即铜绿色假单胞菌)、沙门氏菌、大肠杆菌、白喉杆菌、肺炎球菌及结核杆菌、病毒粒子、阿米巴(变形虫)胞囊、立克次氏体等
下载档案: 传染病在蜂群中传播,必须具备传染源、传播途径和易感动物三个基本环节。
传染病流行过程中三个基本环节的联络示意图
(仿家畜传染病学,1980年)
(1)传染源是指病原体在其中寄生、生长繁殖,并能不断排出体外的蜜蜂。
(2)传播途径是指病原体由传染源排出后,经一定的方式,再侵入其他易感动物所经的途径。
(3)蜂群的易感性易感性是抵抗力的反面,是指蜂群对于某种疾病的容易感受程度。
能引起人和动物致病的微生物叫病源微生物有八大类:
1.真菌:引起面板病。深部组织上感染。
2放线菌:面板,伤口感染。
3螺旋体:面板病,血液感染 如梅毒,钩端螺旋体病。
4细菌:面板病化脓,上呼吸道感染 ,泌尿道感染,食物中毒,败血压症,急性传染病等。
5立克次氏体:斑疹伤寒等。
6依原体:沙眼,泌尿生殖道感染。
7病毒:肝炎,乙型脑炎,麻疹,爱滋病等。
8支原体:肺炎,尿路感染。
生物界的微生物达几万种,大多数对人类有益,只有一少部份能致病。有些微生物通常不致病,在特定环境下能引起感染称条件致病菌。 能引起食品变质,腐败,正因为它们分解自然界的物体,才能完成大自然的物质回圈。
微生物是指那些个体体积直径一般小于1mm的生物群体,它们结构简单,大多是单细胞,还有些甚至连细胞结构也没有。人们通常会借助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构。需要说明的是微生物是一个比较笼统的概念,界线有时会非常模糊。如单细胞藻类和一些原生动物也应算是微生物,但通常它们并不放在微生物中进行研究。
按我国学者提出的分类法将生物分成六界:病毒界、原核生物界、原生生物界、真菌界、植物界和动物界。不难看出微生物在六界中占了四界,因此微生物在自然界中的重要地位是显而易见的,其研究的物件也是十分广泛而丰富的。
微生物(Microani *** )是广泛存在于自然界中的一群肉眼看不见,必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍甚至数万倍才能观察到的微小生物的总称。它们具有体形微小、结构简单、繁殖迅速、容易变异及适应环境能力强等优点。
微生物种类繁多,至少有十万种以上。按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类。
一、真核细胞型微生物 细胞核的分化程度较高,有核膜、核仁和染色体;胞质内有完整的细胞器(如内质网、核糖体及线粒体等)。真菌属于此型别微生物。
二、原核细胞型微生物 细胞核分化程度低,仅有原始核质,没有核膜与核仁;细胞器不很完善。这类微生物种类众多,有细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体和放线菌。
三、非细胞型微生物 没有典型的细胞结构,亦无产生能量的酶系统,只能在活细胞内生长繁殖。病毒属于此型别微生物。
微生物的另一种分类是非致病微生物和致病性微生物
致病微生物是指能引起动物植物的某些疾病的微生物,占少类,比如流感病毒可以起人类、禽类的流感。另外有的一部分是条件致病菌。
较大多数属于非致病性甚至有益性微生物,广泛存在自然界、人体面板粘膜表面等。
目前我国奶粉检测国家标准规定的检测内容主要包括蛋白质、脂肪和微生物三大类,微生物检测包含沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等 而阪崎氏肠杆菌是微生物检测中的关键内容,技术细节见我国2005年5月通过的标准《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 荧光PCR方法》,标准规定必须采用实时荧光定量PCR仪。
实时荧光定量PCR仪是应用十分广广泛的先进的分子生物学病原体检测仪器,为食品安全必备,国家法规(SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法 实时PCR法)等已规定该仪器为食品生产企业生产许可证申领的必备检测装置。
据了解对于实时荧光定量pcr仪没必要选择价格昂贵的进口仪器,国产TL988型实时荧光定量pcr仪已经广泛应用于食品行业的检验检疫,并得到了使用者和行业的认可!
Ⅶ 抗体检测怎么检测(核酸、抗原、抗体检测)
自 2020 年新冠疫情爆发以来,「核酸检测」作为一项检测是否感染的重要指标,开始反复出现在我们的生活中。2022 年 3 月 10 日,国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组发布通知,决定推进「抗原筛查、核酸诊断」的检测模式,在核酸检测基础上增加抗原检测作为补充。
抗原检测是什么?和其他的检测手段有什么不同?这篇文章,我们以新型冠状病毒为例,讲讲常见的快速筛查手段,聊聊相关的原理以及适用范围。
想要对一种疾病或是一种物质进行筛查,我们首先要弄清楚的就是「从何下手」的问题,其次是「如何检测」,让微观世界的变化反映到我们眼前,帮助我们作出判断。
我们面对的是病毒。根据大家耳熟能详的中学生物课知纳者识,病毒是一类由遗传物质和蛋白质外壳组成的类生命体 。如果想对病毒的感染情况进行探测,就需要从它的组分下手。接下来的内容,希望大家带着自己中学的生物知识阅读。
以目前正在困扰我们的 SARS-CoV-2 为例。它属于冠状病毒科下,冠状病毒亚科的乙型冠状病毒属,是已知的第七种能够感染人类的冠状病毒。所有的冠状病毒都是具有 包膜 的 正义单链 RNA 病毒 ,也就是说,它们没码的遗传物质是一条单独的 RNA 链,并且这条 RNA 链可以直接作为 mRNA(信使 RNA)参与翻译,指导蛋白质的合成。
编号为NPRC 2020.00002的毒种,图片由国家病原微生物资源库(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)提供。
我们现在的目的是检测标本中是否存在这种病毒,无论是检测它本身,还是检测病毒带来的产物,能够下手的方向也就是两种:蛋白质外壳(包膜)、遗传物质。
顺着这个逻辑,那最显而易见的方法就是检查它「能不能看到」,但病毒本体小得很,SARS-CoV-2 的直径在 80-120 nm,要想每个标本都拿电镜过一遍是不现实的,人力物力和财力都撑不住。那么更经济实惠的方法,就是通过某些措施,让 病毒的组分 ,或是因为病毒而出现的 某些特殊物质 积攒到一定数量级后发光、变色,出现 宏观表现 。
那么我们的问题就转化成了,选择一种可以观察到宏观尺度变化的方法,和病毒的组分、病毒引发的某种物质产生关联。我们能选择的物质也摆在台面上:病毒的遗传物质,在这里是它的 RNA;病毒的包膜,也就是蛋白质外壳;以及,如果你还记得一些基础的生物知识,人体的免疫系统会在感染病毒之后产生抗体以抵抗入侵,它也是不错的选材。
我们目前采用的几种检测方式,也就从这些物质(以及它们的相关物质)脱胎而来,分别为针对遗传物质的核酸检测,针对包膜的抗原检测,以及针对抗体的血清抗体检测。
作为病毒的遗传物质,核酸序列载写了能够鉴定病毒为某一特定种的基因特征,因此核酸阳性,也就意味着病毒在体内存在过。
我们目前进行的「核酸检测」其实分为两个部分。平常我们进行的「捅鼻子」「捅嗓子」取样和后续的定性是第一部分。在取得标本之后,因为病毒量太少,样本会在实验室中进行一定次数的扩增,并根据荧光反应结果来判定阳性阴性。
第二部分,确定为阳性的样本,还需要通过基因测序,确定样本病毒的分型,以便溯源。这一步已经不属于日常筛查的范畴,但在流行病学调查上具有重大意义,如果有兴趣了解,可以参看 Wikipedia 简要了解。
我们平常参与的作为 筛查 工具的核酸检测,指的就是采集到定性的第一部分。
在感染了 SARS-CoV-2 之后,咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等标本中均可发现病毒核酸。不同部分标本核酸检测的阳性率有一定差异,随着病程进展,各个部位的检出率也会发生变化。
我们习惯称洞察薯呼的「鼻拭子」与「咽拭子」,其实都是采集咽腔后壁的分泌物与组织,前者采集鼻咽,后者采集口咽。也有采用其他标准的,比如唾液等亦可作为检测标本,本质上也是不同地区规定有差异
鼻(咽)拭子与(口)咽拭子已经是综合了阳性率与便利程度的考量。粪便和尿液等其实也可以作为标本采集的对象。而且根据一项对 31 例患者的研究,肛拭子的准确率要高于鼻咽与口咽采样,尤其病程后期,肛拭子确诊病例的鼻拭子阳性率不到 30%。 4 但显然,由于操作的限制,它无法作为早期筛查的首选手段。
接下来的工作,就是从获取的那一点点标本中提取核酸。由于样本中病毒的数量级很小,不足以拿来分析,还需要将其扩增并标记。需要用到的同样是高中学过的知识:聚合酶链式反应(PCR)——这一步看起来麻烦,但由于它的原理和工序已经研究成熟,实际操作中只需要加好试剂送机器,整个核酸检测的过程里最麻烦的还是让待测者安安分分弄来标本(笑)。
各地疾控机构或检测中心会采购合适的核酸 提取试剂盒 与核酸 检测试剂盒 。提取试剂盒负责将 RNA 从混杂的样本(细胞碎屑、分泌物、灰尘等杂质)中提取出来,常见的有磁珠法、离心柱法和释放剂法,不同提取方法可能对后期检测的准确度略有影响 。之后,提纯出的 RNA 就会移交给检测试剂盒(也有一些试剂盒将两者合一),进行之后的工序。
检测试剂盒带着样本在机器中进行的过程,就是这个检测中最主要的反应:RT-qPCR(实时定量逆转录聚合酶链反应)。
接下来需要你捡起高中生物的知识。一般的 PCR 反应有以下几步:
加热:让双链 DNA 解旋变形,成为两条单链; 退火:让混合的单链 DNA 与根据需要复制的片段而设计好的引物结合; 延伸:调整温度,让 DNA 聚合酶顺着引物开始工作,复制出新链,形成新的双链。在对病毒的探测中,我们要做的工作也无非上面几步,只是需要多出两样东西:
在第一次反应之前,使用 逆转录酶 (依赖 RNA 的 DNA 聚合酶),合成病毒单链 RNA 的互补链,组合成 cDNA ; 在退火与延伸的阶段,除了引物和所需的酶外,还需要 TaqMan 探针 。你可以把 TaqMan 探针这样理解:它的主体部分是一段寡核苷酸链,被设计成能和一小部分需要复制的基因片段配对成双链的样子;它一端接了一个荧光分子,另一端接了一个开关(淬灭基团),两者和探针相连时,荧光就会被淬灭基团压制,探测不到。退火时,这个探针会和引物一起结合在要复制的单链片段上。在延伸的过程中,DNA 聚合酶会把挡在面前的障碍物切碎,其中就包括这段探针,淬灭基团和荧光分子就这样分离,荧光就表现出来。
随着循环数的增多,扩增的 DNA 片段和荧光也越来越多。对比每个循环的荧光亮度和前若干次循环的基准亮度,我们就能得出目前的 DNA 片段量,也可以直接用循环数和荧光亮度做定性的判断。
那么具体复制哪一部分呢?既然要探测病毒,那我们就选取最有代表性的核酸片段。现行的标准中,ORF 基因与 N 基因是常用的检测位点。
检测试剂盒负责的就是将提取出的 RNA(样本)投入后,根据试剂盒上的程序说明,设定对应的 PCR 温度与时长,由机器控制完成扩增过程,在固定的环节收集荧光信号,记录对应的循环数(Ct 值)。判断阴性阳性 / 是否还具有传染力的标准,就是看荧光信号达到阈值时,目前循环数是多少。根据目前现行的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》,解除隔离管理的标准为 Ct 值 ≥ 35 。和此前通行的 ≥40 标准相比,出院与解除隔离的时间会大大缩短 。
经 RT-PCR 的核酸检测到现在都是确诊的金标准,因为它在方法学的角度看来,(理论上)可以做到 100% 准确。但核酸检测耗时长、对环境与操作人员要求高,在环境条件达不到标准、物资与仪器不齐全等情况下,大批量的核酸检测会带来巨大人力与财力消耗。
在本次疫情中,我们采用的免疫测定包括了快速抗原检测与抗体检测,它以 抗原-抗体反应 为基本原理,旨在通过抗原与抗体快速的中和效应,以较少的时间成本探测样本中是否存在待测物。两者都属于免疫层析法的范畴。
以盒装方式出现、可以自行操作的抗原检测就很适合作为物资不足、自我测定等情况下的补充。
核酸检测检查的是病毒的(标志性)遗传物质,是病毒的「内里」。那么(快速)抗原检测检查的就是病毒的「外在」,直接检查完整的病毒颗粒。目前通过审批的抗原检测试剂盒包括三种类型:胶体金法、乳胶法、荧光免疫层析法。三者内在原理一致。但其中荧光免疫层析法试剂盒仍然需要专用的检测仪或紫外线手电,不适合家庭自测;胶体金法和乳胶法则都是将检查结果转化成肉眼可见的条带,差别在于用于标记上色的物质不同。
当然,抗原检测自然有它的劣势在,它的 假阴性率 (是阳性但显示阴性)要更高,可能导致漏检错检。但放在一杯茶就能出结果的时间优势面前,准确性上的差距在某些特定情况下可以暂时让步。
图源:How the SARS-CoV-2 EUA Antigen Tests Work | ASM.org
和核酸检测相比,抗原检测增加了「鼻拭子」这一采样途径,降低了个人自测的难度。拭子上的样本在缓冲液中洗脱,取液体滴加在加样孔后,液体会因为毛细作用,带着潜在的抗原,经过一片预载了抗体的区域(结合垫,conjugate pad)。
这片区域上的抗体,是抗目标抗原(SARS-CoV-2)的单克隆抗体,每一个抗体分子都和特别的标记结合,它们与样本中的抗原发生反应,形成抗原-抗体复合物,并随着毛细作用向下一条带流去。
紧接着经过的是检测线(T 线,test line),在检测线上附着的同样是抗目标抗原的单克隆抗体,你可以理解成这里的东西和结合垫上的一样,只是没带标记。此时,如果受测者已经感染了 SARS-CoV-2,他留在样本中的抗原形成的抗原-抗体复合物,会在此处与固定在线上的抗体再次结合。在这里,这些带着标记的复合物不断沉积,最终会显示出一条或深或浅的条带。条带的颜色来源,就是之前结合垫上的抗体分子附着的标记,在胶体金法中是胶体状态的金颗粒,在乳胶法中是上色的乳胶滴,在荧光法中是荧光分子。所以你在使用这类试纸时,会发现刚刚加样结束,液体刚开始扩散的时候,扩散的最前端会有一点点很淡的颜色不断推移,这就是还没有固定沉积的标记的颜色。
接下来,液体继续扩散,经过质控线(C 线,control line),在质控线上附着的是另一种抗体——『抗「抗目标抗原的单克隆 抗体 」 的 单克隆 抗体 』,简称「 二抗 」。这种新的抗体是让上一种抗体在另一种动物的免疫系统中反应得来的,比如结合垫的抗体来自兔,那这里的抗体就来自羊,是羊抗兔的单克隆抗体。也就是说, 二抗的抗原是 之前在 结合垫上的抗体 。这条线就是为了检测液体有没有正常扩散、结合垫上的抗体有没有失效等等而存在的。此时,液体中剩余的大量来自结合垫的抗体就会作为抗原,与质控线上的二抗发生抗原抗体反应,形成复合物,显出一条明显的条带。
由于结合垫上的抗体非常充裕,这条质控线条带会出现得非常快、非常显色,而检测线由于抗原(病毒)数量不一定,显色速度会有差别,但一般在 15 分钟内就足够判断结果。所以不要看 C 线很明显,T 线隐隐约约就觉得「没事了」, T 线不管深浅,只要有,就是阳性 。
具体操作方面,可以参考医政医管局发布的 教学视频。目前国家也在逐步推广抗原自测试剂盒,在一定程度上可以减轻未来医疗与街道的压力。
除了前两种检测手段外,还有一种使用不太多,但同样重要的检测方法,就是同属免疫测定方法的「血清抗体检测」。
抗体检测采用的试剂盒与抗原检测非常接近,但标本的限制更大——由于检测的对象变成了抗体,标本就必须是明确有抗体存在的血液(或血浆、血清)。而且人体在初次感染病毒后,并不会第一时间内产生抗体。抗体能够明确达到被检测的数量级,一般是在初次感染(或接种疫苗)的一到两周之后。这些条件限制了抗体检测不能作为确诊性质的检查。目前,血清抗体检测仅作为一定情况下检查疫苗是否生效,或查验受测者近期是否感染过新冠病毒的方法。
在人体中有五种抗体,分别是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。IgA 主要负责黏膜免疫。IgD 与免疫反应激活有关。IgE 抵御寄生虫,同时也参与过敏反应。剩下的 IgG 与 IgM 就是对抗病原体的过程中,免疫系统派出的主力军。
SARS-CoV-2 作为病原体,人体经刺激主要分泌的就是 IgG 与 IgM 两种。现有的抗体检测试剂盒,主要也是针对人体对 SARS-CoV-2 的 N 蛋白(核衣壳蛋白)或 S 蛋白(刺突蛋白)产生的 IgG 与 IgM。
抗体试剂盒的检测装置外观和抗原检测别无二致。二者的差别就是上文中提到的结合垫、检测线、质控线上附着的物质。
这次,加样孔中滴入的样本可能有对 SARS-CoV-2 的抗体。因此,结合垫上就应当是带了标记物的抗原——当然不可能放活病毒上来。一般这里使用的都是设计检测的抗原蛋白,比如前文提到的 N 蛋白或 S 蛋白,或是重组病毒,无论是哪种,它都必须包含受体结合域(RBD)作为抗体结合的靶点。在检测线上,附着的就是抗 IgM 或抗 IgG 抗体,以捕获结合了抗原的抗体蛋白。最后,质控线上附着抗原的特异性抗体,捕获剩余的游离抗原。
总的说来,三种检测方式针对的是不同的需求,互有优势,互相补充。核酸检测作为金标准,直接查验病毒的 RNA,负责看被检者带不带病毒;抗原检测作为快速检测方法,查的是病毒的蛋白质,但准确度不如核酸检测,对传染力强的感染者更有效;抗体检测查的是疫苗有没有生效、人近期有没有感染过病毒。
近期,新冠疫情在各地卷土重来。Omicron 变种与此前流行的 Delta 变种相比,虽然病死率与重症率明显下降,但潜伏期更短,病毒复制速度更快,传染力明显增强。希望大家在这样的环境中保持健康。