Ⅰ 給出一種酶，如何設計其純化方案
發個實驗給你參考參考！！！
酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定
實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。
實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。
實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「+」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。
表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率
級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化學與分子生物學實驗指導．武漢：武漢大學出版社，2003
2．張龍翔．高級生物化學實驗選編．北京：高等教育出版社，1989
3．許培雅，邱樂泉．離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究．實驗室研究與探索，2002，21(3):82~84
編著者——陳彥，李紹飛
Ⅱ 需要生物化學層析柱的一些介紹 大學生來
1概念：
層析是「色層分析」的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用於有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。
層析利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
2類別：
◆按層析的機理劃分：
吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。
分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。
離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。
凝膠層析：利用某些凝膠對於不同分子大小的組分阻滯作用的不同。
◆按流動相與固定相的不同劃分：
氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。
◆按操作形式劃分：
柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。
柱層析：將固定相裝於柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。
紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣後，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。
薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。
以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬於一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。
3幾種常用的層析：
◆吸附層析
吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、澱粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用於能溶於有機溶劑的有機化合物的分離，較少用於無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統，以獲得最佳分離效果。
◆分配層析
在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和澱粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。
◆離子交換層析
支持物是人工交聯的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用於能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對於蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離後，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區帶。
◆凝膠過濾層析
支持物是人工合成的交聯高聚物，在水中膨脹後成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周圍的水為外水層。控制交聯度以形成不同孔徑的網狀結構。交聯度小的孔徑大，交聯度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小於孔徑的分子進入，大於孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區帶。選擇不同規格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯醯胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。
◆親和層析
在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯結在支持物上，用於純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。
◆氣相層析
屬於分配層析或吸附層析，僅適用於分析分離揮發性和低揮發性物質。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環氧類聚合物。外塗層約為支持物重量的20％。分析時操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區帶十分清晰，是由於揮發性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數分鍾至10餘分鍾。檢測記錄系統繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優點。氣相層析也能用於分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。
◆紙層析
以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用於分析簡單的混合物時可做單向層析。對於復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創了近代層析的發展和應用的新局面。70年代以後，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。
◆薄層層析
在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚醯胺等，根據需要做不同類型的層析。聚醯胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解於濃甲酸中，塗在滌綸片基上，當甲酸揮發後，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優越在於分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用於定性分析。也能用於定量分析和制備樣品。
◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）
70年代新發展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當於34個標准大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上塗一層1～2微米的二氧化硅，經硫醯氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用於制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鍾到10餘分鍾。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適於分析分離不揮發和極性物質。而氣相層析只適用於揮發性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫葯學和環境科學的研究中發揮了重要作用。
◆反相層析
在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發生拖尾現象和保留時間長的問題。如果在支持物上塗上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。
◆同系層析
在核酸分析中，將樣品經核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記後，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。於是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用於寡核苷酸的順序分析。
紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基於被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。
層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用於少量物質的分析鑒定，又可用於大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用於科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫葯衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
層析根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質的層析。