層析實驗裝置圖

㈠ 儀器分析——層析技術二、層析法實驗技術

（一）凝膠層析法

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，並且對分離成分理化斗旦晌性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。

⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。

⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的空鋒層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。

⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定後，將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。

凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無「紋路」或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。

⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡後，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床後，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然後分部收集洗脫液，並對每一餾份做定性、定量測定。

⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反復使用，不必特殊處理，並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析後加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。

如果不遲碰再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封後高壓滅菌保存。

⒍凝膠層析的應用

⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質脫鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然後加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。

⑵用於分離提純：凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。

⑶測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標准品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鍾成分的洗脫體積，並以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標准曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標准曲線的凝膠柱內洗腫後，根據物質的洗脫體積，在標准曲線上查出它的分子量。

⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。

（二）離子交換層析法

離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。

⒈離子交換劑預處理和裝柱對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。

⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。

洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：

C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1

式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。

洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。

⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。

⒌離子交換層析的應用離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。

㈡ 是誰製造出第一台色譜儀

色譜法,又稱色層法或層析法，是一種物理化學分析方法，它利用不同溶質（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質達到相互分離。它的英文名稱為：chromatography這個詞來源於希臘字 chroma和 graphein，直譯成英文時為 color和writing兩個字;直譯成中文為色譜法。但也有人意譯為色層法或層析法。

右圖為高中生物學實驗中的葉綠體色素紙層析分離實驗，就是一種簡單常見的色譜分析方法（紙色譜）。

1906年由 Tswett 研究植物色素分離，提出色譜法概念；他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內，然後加入石油醚使其自由流下，結果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。按光譜的命名方式，這種方法因此得名為色譜法。以後此法逐漸應用於無色物質的分離，「色譜」二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。
在色譜法中，靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相（stationary phase） ；運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相（mobile phase）。

柱色譜（Column chromatography)為向玻璃管中填入固定相，以流動相溶劑浸潤後在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動相，因為待分離物質對固定相的吸附力不同，吸附力大的固著不動或移動緩慢，吸附力小的被流動相溶劑洗下來隨流動相向下流動，從而實現分離。

紙色譜 (Paper chromatography)以濾紙條為固定相，在紙條上點上待分離的混合溶液的樣點，將紙條下端浸入流動相溶劑中懸掛，溶劑因為毛細作用沿濾紙條上升，樣點中的溶質從而被分離。 （圖片就是紙色譜法。）

薄層色譜(Thin-layer chromatography)是在玻璃板上塗以固定相塗層，然後點樣，下端浸入溶劑，同樣自下而上分離。常用於探索柱色譜實驗條件，溶劑和固定相的選擇等。

常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、澱粉等，常用流動相為水、苯等各種有機溶劑。

色譜法的分類方法很多，最粗的分類是根據流動相的狀態將色譜法分成四大類。

色譜法按流動相種類的分類：
┌————————┬———————┬———————————————┐
│ 色譜類型 │ 流動相 │ 主要分析對象 │
├————————┼———————┼———————————————┤
│氣相色譜法 │ 氣體 │ 揮發性有機物 │
│液相色譜法 │ 液體 │可以溶於水或有機溶劑的各種物質│
│超臨界流體色譜法│ 超臨界流體 │ 各種有機化合物 │
│電色譜法 │緩沖溶液、電場│ 離子和各種有機化合物 │
└————————┴———————┴———————————————┘

色譜儀chromatograph

為進行色譜分離分析用的裝置。包括進樣系統、檢測系統、記錄和數據處理系統、溫控系統以及流動相控制系統等。現代的色譜儀具有穩定性、靈敏性、多用性和自動化程度高等特點。有氣相色譜儀、液相色譜儀和凝膠色譜儀等。這些色譜儀廣泛地用於化學產品，高分子材料的某種含量的分析，凝膠色譜還可以測定高分子材料的分子量及其分布。

例：

MC029-GC102氣相色譜儀
該產品為實驗室用的填充相氣相色譜儀，具有熱道、氫焰二種檢測器，定溫控制恆溫槽及氣流控制裝置。可廣泛應用於石油、化工、醫學及廠礦科研單位作為生產控制、科學研究方面的有機、無機氣體和沸點400℃以內的液體樣品進行常量、微量分析。
特點：
□石油煉制工業及其特種油類的製造過程的控制和質量檢驗。
□人造纖維及合成樹脂等對其原料體、中間體聚合過程中的控制或質量檢驗。
□農業的化肥、農葯的分析及合成過程中原料體、中間體的控制或質量檢驗。
□醫葯衛生方面的制葯、勞動防護、有毒氣體的分析分離等。
□生物化學方面的生物液體分離分析研究等。
技術指標：
□檢測器靈敏度：熱導池：S≥1000mVml/mg；載氣H樣品C6H6；氫焰：Mt≤1?0－10g/sec；載氣N2樣品C6H6
□檢測器穩定性：基線漂移：≤0.05mV/h
□層析柱恆溫室：（室溫＋40℃－300℃）；恆溫精度：?.3℃；有效區最大溫差：2℃； 氣化室：最高400℃

㈢ 如圖是紙層析分離葉綠體中色素的裝置圖，層析後得到不同的色素帶，在暗室內用紅光照射四條色素帶，可以看

圖中濾紙條上的四條色素帶①②③④分別是胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b．在暗室內用紅光照射四條色素帶，由於葉綠素主要吸收紅光和藍紫光，所以葉綠素a和葉綠素b色素帶較暗．
故選：C．

㈣ 怎樣畫好層析圖

1．用毛細吸管畫線可使細線盡量細，沿著鉛筆線畫是要保證濾液細線直，從而使分離出來的色素帶整齊。
2．濾紙上的濾液細線如果觸到悔告哪層析液,濾紙上葉碧碼綠體中的色素就會溶解到層析液中,實驗就會失敗，所以濾紙上的濾液細線不能觸到層析液
3.提取葉綠體中色素的關鍵主要是:一、葉片要新鮮、濃綠；二、研廠處班肺直鍍絆僧豹吉磨要迅速、充分；三、濾液收集後,要及時用棉塞將試管口塞緊,以免濾液揮發。
分離葉綠體中色素的關鍵主要是:一、濾液細線不僅細、直,而且含有比較多的色素(可以畫二三次)；二、濾紙上的濾液細線不能觸到友滑層析液。

㈤ 離子交換層析的具體操作

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣：
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度，當A1>A2時為凹形梯度，A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。

㈥ 對硝基乙醯苯胺溫度升高,哪一個產物佔比會提高

本實驗用乙醯苯胺作為起始原料，首先經過硝化獲得了鄰硝基乙醯苯胺和對硝基乙醯苯胺的混合物。接著採取了兩種分離純化的途徑：一種是先將製得的混合物經過重結晶後獲得純的對硝基乙醯苯胺，通過測定固體的熔點來驗證所得對硝基乙醯苯胺的純度。再將重結晶後的產品用氫氧化鈉的醇溶液水解，取水解後的產品作薄層析和熔點測定來確定水解後的產物。另一種方法是直接將硝化後的混合物水解，製得鄰硝基苯胺和對硝基苯胺的混合物。通過薄層分析和熔點的測定來證實兩者的存在。再分別用重結晶和水蒸氣蒸餾的辦法分離純化所獲得的產品。並通過薄層析和測熔點的方法來驗證產品的組成和純度。最後，根據實驗結果分析比較兩種分離純化途徑的優劣。緒言：對硝基苯胺常溫下是淡黃色針狀結晶，易於升華。熔點 148.5℃，沸點 331.7℃，相對密度1.424（20/4℃）。閃點199°，水中溶解度為0.0008g。微溶於冷水，溶於沸水、乙醇、乙醚、苯和酸溶液，有毒，空氣中容許濃度為5mg/m3。吸入、口服和皮膚接觸有害。所以在實驗過程中要盡量避免與之接觸。對硝基苯胺是染料工業極為重要的中間體，可直接用於合成：對苯二胺，鄰氯對硝基苯胺， 2.6-二氯-4硝基苯胺，5-硝基-2-氯苯酚等，同時還是防老劑，光穩定劑，顯影劑等的原料。可作黑色鹽 K，供棉麻織物染色、印花之用。並且可作農葯和獸葯的中間體，在醫葯工業中可用於生產氯硝胺、卡巴腫、硝基安定、喹啉脲硫酸鹽等。還可用於生產對苯二胺；抗氧化劑和防腐劑等。因此對硝基苯胺的合成具有很大的應用價值。工業上生產對硝基苯胺的方法有乙醯苯胺的硝化水解和對硝基氯苯氨解兩種方法。本實驗採用的是乙醯苯胺硝化水解的方法，具體步驟將在實驗部分給出。反應原理如下：1、乙醯苯胺的硝化
2、硝基乙醯苯胺的水解：而純化和分離的辦法主要採取了薄層析、重結晶、水蒸氣蒸餾三種辦法。三者的分離原理如下。薄層析：薄層色譜（TLC）是用來鑒別產物成分與辨別產物純度的有效方法。不同物質的極性不同因此與展開劑的作用力不同，當物質隨展開劑攀援而上時會由於攀援速度不同而分離開來。
溶劑前沿與起始線間距離品點與起始線距離
溶劑前沿
樣樣品點與起始線間距離品點與起始線距離
起始線
重結晶：重結晶是純化靜態物質的普適的、最常用的方法之一。用適當的溶劑把含有雜質的晶體溶解，配成接近沸騰的濃溶液，趁熱濾去不溶性雜質，使濾液冷卻析出結晶，以達到純化晶體的目的。水蒸氣蒸餾：有機物與水一起共熱，當體系總的蒸氣壓等於大氣壓力時，體系沸騰，此時，有機物在低於100 oC的溫度下隨蒸氣一起蒸出來，這樣的操作叫做水蒸氣蒸餾。♦ 水蒸氣蒸餾的用途及適用場合：水蒸氣蒸餾是用來分離和提純液態或固態有機化合物的一種方法，常用於下列場合：（1）某些沸點高的有機化合物，在常壓蒸餾雖可與副產品分離，但易將其破壞。（2）混合物中含有大量樹枝狀雜質或不揮發性雜質，採用蒸餾、萃取等方法都難於分離；（3）從較多固體反應物中分離出被吸附的液體。♦ 被提純物質必須具備以下幾個條件：（1）不溶或難溶於水；（2）共沸騰下與水不發生化學反應；（3）在100 oC左右時，必須具有一定的蒸氣壓[至少666.5 ~ 1333 Pa(5 ~ 10 mmHg)]實驗參數表格：
名稱 分子量 性狀 折光率 比重 熔點（oC） 沸點（oC） 溶解度（/100g）
水 醇 醚
乙醯苯胺 135.17 白色有光澤片狀結晶 1.5860 1.219 114.3 304 0.46（20oC） 36.9（20oC） 溶
臨硝基乙醯苯胺 180.16 淡黃色片狀或棱狀晶體 1.4149 94 100（0.133 KPa) 溶於沸水微溶於冷水 溶於乙醇 溶於乙醚
對硝基乙醯苯胺 180.16 無色晶體 1.41 215.6 100（1.06x10-3KPa） 溶於熱水 溶 溶
鄰硝基苯胺 138.13 橙黃色針狀晶體 1.44 69.7 284.5 微溶於冷水溶於沸水 溶於乙醇 易溶於乙醚
對硝基苯胺 138.13 淡黃色針狀晶體，易升華 1.424 148.5 331.7 0.0008g（冷水）溶於沸水 溶 溶
實驗內容：
實驗流程圖
鄰、對硝基苯胺
對硝基乙醯苯胺
測熔點 測熔點 薄層析
重結晶
水蒸汽蒸餾
水解

對硝基苯胺
對硝基苯胺
鄰硝基苯胺
測熔點 薄層析
薄層析
測熔點
薄層析
測熔點
對硝基苯胺
實驗步驟1、乙醯苯胺的硝化：在100 mL三口燒瓶中放入5.00g製得的乙醯苯胺，加入10.0mL冰醋酸。安裝上電磁攪拌裝置。在三頸瓶口分別裝上溫度計、迴流冷凝管、恆壓滴液漏斗。在恆壓漏斗中加入4.0 mL濃硝酸（比重為1.14 g/mL， 0.03 mol）和8 .0mL濃硫酸（比重為1.84 g/mL）配成混酸。三頸瓶外用電熱煲控溫在50±5 oC，邊攪拌邊緩慢加入混酸（約需20 min），加完後60 oC左右繼續反應1小時。然後將反應液倒入20 g碎冰中，即有黃色沉澱析出，過濾、水洗至中性。
實驗裝置圖（一）硝化裝置2、硝基乙醯苯胺的水解：將得到的固體均分為兩份，一份進行重結晶，粗產品轉移到50ml燒瓶中，加入約10mL乙醇，在攪拌下加熱至沸騰。觀察有未溶解的固體，再補加乙醇約8mL後固體全部溶解，最後補加了5mL乙醇。稍冷後，加入0.5g活性炭，並煮沸10min。在保溫漏斗中趁熱過濾除去活性炭。濾液倒入熱的燒杯中。然後自然冷卻至室溫，冰水冷卻，待結晶完全析出後，進行抽濾。用少量冷水洗滌濾餅兩次，壓緊抽干。將結晶轉移至表面皿中，烘乾後測定重結晶後固體的熔點，再將重結晶後的固體用自配的氫氧化鈉醇溶液在加熱沸騰的情況下迴流水解半小時，再加入3.0mL水加熱沸騰的情況下迴流水解20min。再將溶液稍冷後倒入20 g冰水中，過濾，用水洗至弱鹼性，烘幹得水解產物。取水解後的產物做薄層分析和熔點測定。水解裝置 + 重結晶裝置 實驗裝置（二）2.2 取另一份直接水解，水解方法與2.1中一樣，水解之後仍將固體均分為兩分，一份進行重結晶，重結晶的方法與2.1類似，只是乙醇的用量減半。再將重結晶的樣品烘乾測定熔點，並做薄層分析。將另一半固體進行水蒸氣蒸餾，將蒸餾後收集到的餾分每次用10mL氯仿分兩次萃取。將萃取所得液體再次蒸餾，直至燒瓶內溶劑僅剩3mL自然冷卻至室溫，將所得樣品進行薄層分析。蒸餾裝置 萃取裝置實驗裝置（三)實驗結果與討論：1.實驗結果：1.1熔點測定結果
物質 T初（oC） T全（oC） 熔距ΔT（oC） 標准熔點T（oC）
對硝基乙醯苯胺（初產品重結晶） 165.0 193.0 28.0
168.0 190.0 22.0 215.6
對硝基苯胺（重結晶加水解） 144.0 149.0 5.0
143.0 152.0 9.0 148.5
直接水解的初產品 60.0 63.0 3.0
61.0 63.0 2.0 69.7
水解+重結晶後的產品 59.0 65.0 6.0
61.0 66.0 5.0 69.7
對硝基苯胺（水解+水蒸氣蒸餾） 145.0 149.0 4.0 148.5
146.0 150.0 4.0
1.2薄層析結果：
物質 Rf值 樣點黃色深淺 樣點性狀
重結晶再水解產品 樣點1 0.59 顏色很淺， 橢球狀
純鄰硝基苯胺 0.63 顏色深 橢球狀
樣點2 0.28 顏色極深 長條楔形
純對硝基苯胺 0.28 顏色深 橢球狀
直接水解的初產品 樣點1 0.59 顏色深 橢球狀
純鄰硝基苯胺 0.61 顏色深 橢球狀
樣點2 0.28 顏色淺 橢球狀
純對硝基苯胺 0.28 顏色深 橢球狀
水解+重結晶後的產品 樣點1 0.56 顏色深 橢球狀
純鄰硝基苯胺 0.56 顏色深 橢球狀
樣點2 0.28 顏色很淺 橢球狀
純對硝基苯胺 0.28 顏色深 橢球狀
對硝基苯胺（水解+水蒸氣蒸餾） 樣點1 無 無 無
純鄰硝基苯胺 0.61 顏色深 橢球狀
樣點2 0.27 顏色深 橢球狀
純對硝基苯胺 0.27 顏色深 橢球狀
鄰硝基苯胺（水解+水蒸氣蒸餾） 樣點1 0.54 顏色深 橢球狀
純鄰硝基苯胺 0.54 顏色深 橢球狀
樣點2 無 無 無
純對硝基苯胺 0.26 顏色深 橢球狀
2、實驗討論（1）熔點測定分析由硝化產物直接重結晶得到的對硝基乙醯苯胺的熔點測定結果來看，熔程長，熔點相較於標準的對硝基乙醯苯胺的熔點-215.6oC來說偏低了許多。造成該實驗結果的主要原因有：① 從得到的產品的晶型來看，產品呈土黃色泥狀，基本看不出晶態。而晶體的晶型對晶體的熔點有很大的影響，我所得到的產品更偏向於是多晶或非晶，所以熔程較長。② 熔點低說明所含的雜質多，重結晶的效果欠佳，包含的雜質初步判斷為臨硝基乙醯苯胺。判斷的理由是硝化過程中，在酸的作用下會有少量的乙醯苯胺被水解生成苯胺，但由於量少，在重結晶的過程中會全部溶解於溶劑中，不會給實驗結果帶來很大影響，而含量較多的鄰硝基乙醯苯胺則會因為重結晶的的效果不佳而使得實驗結果偏低。③ 熔點儀的溫度計測溫不準，造成所得數值偏低，這在其他的幾個熔點測定實驗中也可以看出。④ 晶體不夠乾燥。①、② 兩個解釋最本質的原因是重結晶的過程中所加的溶劑量不夠，溶劑用量不足會使得鄰硝基乙醯苯胺在低溫時並不能完全溶解在溶劑中，而隨著對硝基乙醯苯胺一起析出，再加上晶體析出過程中，由於溶劑量過少，溶質析出過快，成核密度太大，微粒不能形成晶體而是以沉澱形式存在，且相對表面積增大，吸附現象嚴重，總的結果就是熔程長、熔點偏低。
（2）薄層析結果分析①從薄層析結果來看，鄰硝基苯胺的樣點隨溶劑移動的速度更快，比移值更大，是由於鄰硝基苯胺的極性比對硝基苯胺小，因此與吸附劑的結合力更弱，在吸附與脫吸的交替過程中脫吸占上風，因此與溶劑一起攀爬的速度快於對硝基苯胺。②薄層析中，硝化後重結晶再水解的樣品的樣點拉得很長，並不是清晰的一點，說明產品純度不高。除了有鄰硝基苯胺和對硝基苯胺外還有其他有色雜質，這可能是硝化過程中由於溫度控制不當，有多硝基化合物生成。多硝基化合物的生成會使得產品顏色加深，而我所得到的產品顏色確實很深。由此觀之確實有少量多硝基化合物存在。（3)綜合分析1、為什麼要用氫氧化鈉醇溶液作為水解試劑：胺基具有給電子性會使醯基碳鈍化，因此水解所需的條件要劇烈一些，氫氧化鈉醇溶液鹼性強，水解效果好，以乙醇作溶劑提供了一個均相體系使反應更容易發生。2、水解產品分析重結晶後水解的產品中對硝基苯胺占絕大部分，但仍有少量的鄰硝基苯胺，這從薄層析和熔點測定的結果中都可以看出。薄層析結果顯示樣品存在兩個樣點，一個與純的鄰硝基苯胺樣點移動的速度一致，但顏色很淺；一個與純的對硝基苯胺樣點移動的速度一致，但顏色深。熔點測定時，熔點與對硝基苯胺的熔點十分接近。這兩個實驗結果都表明產物主要是對硝基苯胺。造成最終的產品中仍有鄰硝基苯胺的原因很大一部分在於重結晶時的效果不好，有鄰硝基乙醯苯胺，所以在水解之後產品不純。直接水解後的樣品熔程短，熔點為62oC，十分接近鄰硝基苯胺的熔點，而薄層色譜中樣品仍有兩個樣點，一個與純的鄰硝基苯胺樣點移動的速度一致，顏色很深；一個與純的對硝基苯胺樣點移動的速度一致，但顏色很淺。由熔點測定結果和薄層色譜結果可以得出，直接水解的產物中鄰硝基苯胺居多。將初產品重結晶後，測得的熔點為63oC，相比於未重結晶的產品更接近純的鄰硝基乙醯苯胺的熔點，但改善不大。除了熔點改善不大之外，薄層色譜也十分相近。另外還有明顯的熔程變長。而理論上重結晶後應該會使得熔程變短，熔點更接近真實值，所以實驗結果與理論之間出現了悖論。這其中的原因是我在直接水解之後，將水解後的產品

㈦ 紙層析法可分離光合色素，下列分離裝置示意圖中正確的是（）A．B．C．D

A、層析液是由2份丙酮和1份苯混合而成，具有一定的毒性，因此用橡皮塞賽緊瓶口內，A錯誤；
B、層容析液容易揮發，需要用橡皮塞賽緊瓶口，另外濾液細線觸到層析液，則色素溶解在層析液中，濾紙條上得不到色素帶，B錯誤；
C、有濾液細線的一端朝下，並沒有觸到層析液，則濾紙條上分離出四條色素帶，C正確；
D、濾液細線觸到層析液，則色素溶解在層析液中，實驗失敗，D錯誤．
故選：C．

㈧ 綠葉中色素的提取與分離實驗的四步改進|色素帶

「綠葉中色素的提取與分離」實驗的目的是通過實驗操作，使學生對綠葉中色素的種類及含量有直觀感性的認識。 根據以往經驗，學生實驗失敗的原因有：研磨不充分，畫線粗而不均勻，層析時濾紙條貼壁或誤加其他試劑污染了層析液。現針對研磨、畫線、層析等步驟，對此實驗作出四點探究與改進。下面所用材料皆為白菜葉，層析液皆採用石油醚、丙酮、苯(20：2：1)配方。

1研磨方法的改進――兩步研磨法

1.1操作步驟
採用課本的方法將試劑全部加入再研磨，會使研缽內液體較多，不易著力，容易導致研磨不充分。過濾得出的濾液呈淡綠色，使分離的色素帶顏色過淺。
研磨時加入二氧化硅有助於研磨充分，加入碳酸鈣可防止研磨中色素被破壞，加入無水乙醇為了溶解與提取色素。針對三種試劑的作用，可減少用量，分次加入，兩步研磨，以更好地提取葉綠素。具體步驟如下：
(1)稱取3g綠葉，剪碎，放入研缽。
(2)加入少量二氧化硅及碳酸鈣，研磨至初步呈糊狀。
(3)加入5mL無水乙醇。
(4)研磨至均勻後，靜置2min。
(5)過濾。

1.2結果討論
分兩步研磨，第一步有利於研磨充分，省時省力。待綠葉初步呈糊狀再加入無水乙醇繼續研磨，並適當靜置，有利於葉綠素充分溶解到乙醇中，得出的濾液呈墨綠色，保證下一步色素分離的效果。

2畫線方法的改進――毛筆畫線法

2.1操作步驟
(1)距濾紙條尖角端1cm用鉛筆畫一橫線。
(2)用未泡開的新毛筆尖端沾取少量濾液，沿鉛筆線均勻畫出一條濾液線。
(3)待濾液線干後，重復3-5次。

2.2結果分析
(1)毛筆畫線法所需用具簡易。毛筆易購買，可重復使用，且筆桿長，沾取濾液非常方便。
(2)毛筆畫線與學生書寫習慣相近，更容易畫出平直的細線。而且濾液細線容易晾乾，相同的時間內可反復畫更多次，彌補每次畫線所吸收的色素量較少的不足，保證濾液線含有足夠的色素。
(3)毛筆輕柔，多次描畫也不會劃損濾紙，利於層析分離。
(4)用毛筆畫線，濾紙條吸收葉綠素更加均勻集中，色素分離更快，也更平整。有利於在更短的時間內，正確認識綠葉色素的種類和含量，尤其能很好地體現課本所給出的各種色素含量的比例關系(圖1)。


3濾紙條形狀對好兄實驗效果的影響

3.1操作方法
課本要求將濾紙條的一端剪去兩角，以減少濾紙邊緣的浸潤現象，讓色素帶跑得更平直。現用七種形狀的濾紙條作對比，探究何種形狀的濾紙條利於色素帶的平直。畫線方法均採用毛筆畫線法。

3.2實驗結果(圖2、圖3)



3.3結果討論
從七種形狀的濾紙條的層析效果圖可見，一端較尖長的濾紙條(3、4、5號)能更好地減低邊緣浸潤作用。同時，長梯形端能起到提示學生畫線部位的作用。作為毛筆畫線法的重復實驗也可見，毛筆畫線法所得出的色素帶都很平直均勻。

4層析裝置的改進――簡易層析瓶

教科書採用試管作為層析的裝置。雖然試管口小，可減少層析液的揮發，但試管空間窄而深，容易造成濾紙條貼壁，致使實驗失敗。現將裝置改為簡易層析瓶，製作方法如下：
(1)取100mL燒杯。
(2)取一圓形濾紙，用小刀在濾紙上刻出間隔合理的多個缺口，用於插入和固定濾紙條。
(3)用透明膠將製作好的濾紙固定在燒杯口上，作為簡易蓋子。
(4)插入濾紙條。
此裝置(圖4)可同時放置多條濾紙條，而且位置固定，可避免濾友友襲紙條貼壁或相互交疊。簡易蓋子可減少層析液揮發，同時能避免學生因錯誤操作而倒入濾液，污染層析液，致使實驗失敗。此裝置製作簡便，可重復使用，能滿足示範性告沒高中上千學生做實驗的需要，實驗員每節課後統一回收和加液也比較方便(可使用針筒或掀開蓋子)。

5實驗結論

經實踐證明，採用了兩步研磨法、長梯形濾紙條、毛筆畫線法及新式層析裝置四步改進之後，學生實驗的成功率大大提高，接近95％。而且所顯示的色素帶比較平整，能很好地體現色素種類與含量，尤其是體現教科書所給出的各色素含量之間的比例關系。操作上由於減少了量取層析液等步驟，更省時省力，有利於教學時間的安排。

㈨ 細胞的能量供應和利用

本實驗的地位和作用

光合作用是高中生物學習的重點和難點內容。葉綠體是光合作用的場所，做好葉綠體中色素的提取和分離實驗，有助於學生理解光合作用色素的種類和作用、加強學李散生對光合作用的理解和掌握。

創新動機

在提取葉綠體中色素時要用到丙酮，進行色素分離時要用層析液。丙酮和層析液有很強的揮發性，學生在進行實驗的過程中難免會吸入一定的揮發性物質，對身體健康產生影響。所以，本實驗要求在通風的條件下進行，實驗結束後一定要用肥皂將手洗凈。因此，許多教師希望能通過改進實驗，降低有毒物質的揮發，保護學生的身體健康。

新教材實驗存在的問題及分析

1、新教材中實驗的原文是：「將3 ml層析液倒入試管中，將濾紙條（有濾液細線的一端朝下）輕輕插入層析液中，隨後用棉塞塞緊試管口。注意不能讓濾液細線觸敬粗及層析液。」

2、假如我們按照新教材中的實驗要求操作，將 3 ml層析液倒入不同型號大小的試管中，就會看到下面的現象，層析液的高度都會超過1 cm，濾液細線會觸及層析液而導致實驗失敗。

3、建議教材做如下改進：「將適量的層析液倒入試管中」。

改進一：自製密閉式色素分離器

實驗裝置如下圖所示

操作步驟：

1、實驗前教師用注射器預先吸取適量的層析液。

2、色素分離時將底座倒入適量的水。

3、將畫好濾液線的濾紙條用夾子夾好，罩上罩子。

4、用注射器緩緩推入預先吸取的層析液。注意：不能讓層析液觸及濾液線。

5、色素分離後，及時用注射器將層析液吸回，進行觀察。

改進二：簡易色素分離裝置

實驗裝置如圖所示

操作步驟：

1、將畫好濾液線的濾紙條插入膠塞的切口處。

2、將3 ml層析液倒入錐形瓶中，將有濾紙條的膠塞插入亮擾鎮錐形瓶中。

3、色素分離後，及時將濾紙條取出，待濾紙條乾燥後進行觀察。

三種色素分離裝置的對比

實 驗 裝 置

優 點

缺 點

用燒杯進行色素分離

操作簡單

層析液的揮發量較大，對學生的身體健康產生不利影響。

用試管進行色素分離

可減少層析液的揮發

需試管架固定，層析液的量不好控制。

自製密閉式色素分離器

操作簡單，美觀大方，經久耐用，色素分離和觀察的全過程在密閉容器內進行，防揮發性能強。

沒有現成的設備，需要重新生產、配置。

簡易色素分離裝置

①比用試管操作簡單、容易固定；

②層析液的揮發量比用燒杯小很多。

③ 可用現成的設備組裝，立即推廣。

必須將濾紙條取出乾燥，只能一定程度降低有毒氣體揮發。