做激光共聚焦掃描顯微鏡實驗用的樣品裝置

『壹』 激光共聚焦顯微鏡的工作原理是什麼如何准備流式細胞的實驗樣品

採用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射後發出的熒光被物鏡收集，並沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱薯拿鍵為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對於焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦於照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的敏並光，可以會聚在探測孔范圍之數巧內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔後的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。

『貳』 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的激光掃描共聚焦顯微鏡基本結構

激光掃描共聚焦顯微鏡系統主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數字信號處理器、計算機以及圖像輸出設備等。 顯微鏡是LSCM的主要組件，它關繫到系統的成像質量。顯微鏡光路以無限遠光學系統可方便地在其中插人光學選件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑平場復消色差物鏡，有利於熒光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換，濾色片組的選取，載物台的移動調節，焦平面的記憶鎖定都應由計算機自動控制。
激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規熒光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連接，使激光能進入顯微鏡物鏡照射樣品，並使樣品發射的熒光到達檢測器；需有光路轉換裝置，即汞燈與激光轉換，同時汞燈光線強度可調。 激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統，常用的激光器包括以下三種類型：
半導體激光器：405nm（近紫外譜線）
氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍綠光）
氦氖激光器：543nm（綠光-氦氖綠激光器）633nm （紅光—氦氖紅激光器）
UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光） 風冷、水冷冷卻系統及穩壓電源。
激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發射的一定波長的激發光，光線經放大後通過掃描器內的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦於樣品的焦平面上，樣品上相應的被照射點受激發而發射出的熒光，通過檢測孔光欄後，到達檢測器，並成像於計算機監視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。
激光掃描共聚焦熒光豎凳顯清碧微鏡相對普通熒光顯微鏡的優點（1）：LSCM的圖象是以電信號的形式記錄下來的，所以可以採用各種模擬的和數字的電子技術進行圖象處理：（2）LSCM利用共聚焦系統有效的排除了焦點以外的光信號干擾，提高了解析度，顯著改善了視野的廣度和深度，使無損傷的光學切片成為可能，達到了三維空間定位；（3）由於LSCM能隨時採集和記錄檢測信號，為生命科學開拓了一條觀察活細胞結構及特定分子、離子生物學變化的新途徑：（4）LSCM除具有成像功能外，還有圖象處理功能和細胞生物學功能，前者包括光學切片、三維圖象重建、細胞物理和生物學測定、熒光定量、定位分析以及離子的實時定量測定；後者包括黏附細胞的分選、激光細胞纖維外科及光陷阱技余正旅術、熒光漂白後恢復技術等。

『叄』 激光掃描共聚焦顯微鏡的激光共聚焦顯微鏡結構

激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。
在結構 配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統 (包括數據採集、處理、轉換、應用軟體)、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統等部分 [2]。由於該儀器具有高解析度、高靈敏度、「光學切片」（Optical sectioning）、三維重建、動態分析等優點，因而為基礎醫學與臨床醫學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優勢，只要能用熒光探針進行標記的樣品就可用其觀察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態，也可以用於細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量, 配合焦點穩定系統可以實現長時間活細胞動態觀察。

『肆』 可以與激光共聚焦掃描顯微鏡聯用的儀器有

共聚焦拉曼成像儀。與激光共聚焦掃描顯微鏡進行聯用的是共聚焦拉曼成像儀。激光遲御共聚焦掃描顯微鏡是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光冊培掃描裝置，使用紫外光或可見光激發州旦唯熒光探針的儀器。

『伍』 共聚焦的共焦顯微

共焦顯微技術是由美國科學家M.Minsky在1957年提出的，當時的主要目的是消除普通光學顯微鏡在探測樣品時產生的多種散射光。20世紀60年代通過提高掃描精度突破了普通寬場成像的解析度限制，在20世紀80年代研製成商用共焦顯微鏡。共焦顯微鏡分為普通光照明激發和激光照明激發兩種類型，而以後者應用最為廣泛。
激光掃描共聚焦顯微鏡（Lsaer scanning confocal microscope，LSCM）是一種先進的分子生物學和細胞生物學研究儀器。 它在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，結合數據化圖像處理技術，採集組織和細胞內熒游標記圖像，在亞細胞水平觀察鈣旦帆等離子水平的變化，並結合電生理等技術觀察細胞生理活動與細胞形態及運動變化的相互關系。由於它的應用范圍較廣泛，已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學和葯理學等研究領域中很重要的研究技術。 激光掃描共聚焦顯微鏡工作原理
激光掃描共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源，在熒游標記標本的焦平面上逐點掃描，採集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT)，再經過信號處理，在計算機監視屏上形成圖像。對於物鏡焦平面的焦點處發出的光在針孔處可以得到很好的會聚，可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑，對比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過針孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近為0%），因而在探測器上產生的信號就越小，影響也越小。正由於共焦顯微僅對樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的解析度，並在生物學中獲得了廣泛的應用。 共聚焦掃描顯微鏡
共聚焦顯微鏡主要由五部分組成：顯微光學系統、掃描裝置、光源、檢測器和應用軟體系統。整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平台界面中方便靈活地進行。（1）顯微光學系統：
顯微鏡是共焦檢測系統常用的組件，是系統成像質量的核心部分。顯微鏡光路一般採用無限遠光學系統結構，可以方便地在其中插入光學元件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑、平場復消色差物鏡，有利於熒光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換、濾色片組的選取、載物台的移動調節、焦平面的記憶鎖定等都可以由計算機自動控制。
（2）掃描裝置：
掃描裝置是激光共聚焦檢測系統進行大范圍檢測必需的組件，通常有由絲杠導軌組成的XY平移掃描、由陣鏡擺動的掃描等方式。前種掃描方式可以實現大范圍區域的掃描，而後者掃描范圍相對小一些，不過陣鏡擺動掃描可以很快，圖像數尺採集速度可以大大提高，有利於對那些壽命短的離子作熒薯遲高光測定。掃描系統的工作程序由計算機自動控制，與信號採集相對應。
（3）光源：
光源有單色光（激光）和多色光（汞燈、氘燈、鹵素燈等）。激光源可以使用多譜線氬離子激光器，它提供發射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光；另外，氦氖綠激光器提供發射波長為543nm的綠光，氦氖紅激光器提供波長為633nm的紅光。激光源還可以用其他半導體激光器。
（4）檢測器：
檢測器通常採用光電倍增管（PMT）、光子計數器等，通過高速A/D轉換器，將信號輸入計算機以便進行圖像重建和分析處理。通常在PMT前設置針孔，可以採用固定大小針孔或由計算機軟體來控制的可變大小針孔。如果是檢測熒光，光路中還應該設置能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要；也可以採用光柵或棱鏡分光然後進行光譜掃描。
（5）應用軟體系統：
應用軟體系統可以根據具體需要設置各種功能，但有一點是共同的，就是將掃描位置坐標與檢測器接收的信號一一對應起來，並以圖像的方式進行儲存與顯示。 共焦顯微鏡從產生至今獲得了巨大的發展，掃描方式從最初的狹縫掃描方式（掃描速度較快，圖像解析度不高），到階梯式掃描技術（提高了圖像解析度，標本制備要求太高），再到驅動式光束掃描器（掃描速度較快，符合共聚焦原理）。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的光源設計和分光採集技術也有較大的改進，主要集中在如下幾個方面：
（1） 現代的激光掃描共聚焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器。選擇激光光源時，一方面要滿足研究工作對波長的需求，另一個方面要考慮到激光光源的壽命。
（2）最新一代激光掃描共聚焦顯微鏡可以用棱鏡狹縫分光的新技術，配上合適的激光源後，能夠擺脫傳統的波長濾片組的限制，連續和自由地選擇最佳波長。
（3）用於激光掃描共聚焦顯微鏡的物鏡也做了較大的改進，不但具有平場復消色差特性，而且能與高速掃描功能相匹配。
共焦顯微鏡發展至今又產生了新的類型，如針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡和雙光子共聚焦顯微鏡：
（1）針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡：
針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡是為了解決快速變化過程的共聚焦檢測問題而提出的，其核心是雙碟片專利技術，由日本Yokogawa Electric公司發明，包括微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉。
與常規激光共聚焦方法不同，針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡採用CCD作為探測器，無需載物台進行掃描運動，只要微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉，就可以對物體進行快速共焦檢測，最高全幅採集幀速度達到1000幀/s，是活細胞在體熒光成像的重要工具。
（2）雙光子共聚焦顯微鏡：
雙光子共聚焦顯微鏡
雙光子共聚焦顯微鏡是為了解決生物檢測中樣品染料標記的光漂白現象而提出的，因為共焦孔徑光闌必須足夠小以獲得高解析度的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發出的熒光，包括從焦平面發出的熒光，這樣就要求激發光必須足夠強以獲得足夠的信噪比；而高強度的激光會使熒光染料在連續掃描過程中迅速褪色（即光漂白現象），熒光信號會隨著掃描進程的進行變得越來越弱。除此之外，還有光毒作用問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產生諸如單態氧或自由基等細胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發光的光功率密度以保持樣品的活性。針對活性樣品的研究，尤其是活性樣品生長、發育過程的各個階段，光漂白和光毒現象將使這些研究受到很大的限制。
雙光子激發原理
雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個較低能量（即更長的波長）的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間後，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個能量較高（即波長為長波長一半）的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子共聚焦顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。
雙光子共聚焦顯微鏡有很多優點：1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子共聚焦顯微鏡比普通共聚焦顯微鏡更適合用來觀察厚標本、活細胞，或用來進行定點光漂白實驗。 共聚焦顯微鏡有較高的解析度，而且能觀察到樣本隨時間的變化。因此，共聚焦顯微技術在生物學研究領域起著不可或缺的作用。以下為共焦顯微技術的幾個主要應用方面：
（1）組織和細胞中熒游標記的分子和結構的檢測：
利用激光點掃描成像，形成所謂的「光學切片」，進而可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒游標記結構的總體圖像，因此可以用於觀察切片和一些表面不平的標本，特別是研究具有長突起的神經元時更有使用價值。同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析。
（2）定量或半定量測量Ca2+和pH等細胞內離子濃度及變化：
激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像，這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。最好與電生理等技術相結合來觀察離子變化與電生理學指標的相關性。
（3）熒光光漂白及恢復技術：
利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區域的某種熒光淬滅，然後觀察鄰近相同的熒游標記物重新擴散入該區域的速度和方式，從而分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。
（4）長時程觀察細胞遷移和生長：
激光掃描共聚焦顯微鏡的軟體一般均可自動控制地進行定時和定方式的激光掃描，而且由於新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測效率的提高，只需要很小的激光能量就可以達到較好的圖像質量，從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷，因此，可以用於數小時的長時程定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。
（5）其他的生物學應用：
用高能量激光束進行細胞損傷和損毀實驗，一般要用紫外激光束進行細胞損毀；細胞間通訊研究；光解籠鎖活化技術等。

『陸』 2020-02-12小劉科研筆記之激光共聚焦原子力顯微鏡

形貌、成分和結構的表徵是材料的生長、鑒別、加工、研究和應用等過程中很重要的一個步驟。本篇筆記將以華慧高芯網激光共聚焦原子力顯微鏡為例描述該設備在材料表徵的功能與應用。

激光共聚焦原子力顯微鏡具有常規光學顯微鏡、激光顯微鏡、原子力顯微鏡三種功能，常規光學顯微鏡和激光顯微鏡同軸，其中激光顯微鏡採用405nm激光光源，平面X、Y解析度能達到120nm，可進行小尺寸的樣品測試且便於原子力測試時進行樣品定位。

圖2 和3分別為激光顯微鏡獲得的光刻膠圖形和聚合物劃痕的三維形貌握橘察圖。

如圖1所示，小尺寸樣品進行激光成像測量。同時，激光下具有三維成像、粗糙度測量、粒子分析等功能。對於尺寸和粗糙度較大等不適用於原子力測試時，可選擇採用激光測量。

圖2 和3分別為激光顯微鏡獲得的光刻膠圖形和聚合物劃痕的三維形貌圖。

激光共聚焦顯微鏡是在普通光學顯微鏡的基礎上對成像原理作了改進，加裝了激光掃描裝置，同時利用計算機成像處理技術提高成像解析度 。

如圖4所示，激光共聚焦顯微鏡是使激光掃描束通過光柵孔形成點光源，在焦平面上逐點掃描，採集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管，經過信號處理形成圖像。

由於激光光源的光柵針孔和探測針孔對物鏡焦平面是共軛的，因此針孔只接受掃描聚焦點光斑處信息，能夠對樣品的深層次進行觀察，鑒定，通過對連續層次上的共聚焦圖像處理， 可以實現真正的三維圖像重段茄建 。

原子力顯微鏡具有很高的平面和深度測量精度，在納米尺度測量范疇具有廣泛的應用。 不僅僅能夠觀察表面形貌特徵，還能獲取准確的數值形式的表面高低起伏狀態，對表面整體形象的分析得到樣品表面的粗糙度，顆粒度、孔結構和孔徑分布等參數。廣泛用於半導體、高分子聚合物、生物科學等行業。

                                                                                                          ▲圖5. 納米片樣品的AFM測試

                                                                                                             ▲圖6. 金屬薄膜的三維形貌

                                                                                                           ▲圖7. 聚合物三維形貌圖

                                                                                                           ▲圖8. 碳材料三維形貌圖

如圖9所示，AFM就是將探針裝在一彈性微懸臂的一端，微懸臂的另一端固定，當探針在樣品表面掃描時，探針與樣品表面原子間的排斥力會使得微伍盯懸臂輕微變形，這樣微懸臂的微小變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束激光經微懸臂的背面反射到光電檢測器，可以精確測量微懸臂的微小變形，這樣就實現了 通過檢測樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結構。

 

AFM有三種工作模式： 接觸模式、非接觸模式、輕敲模式。

接觸模式 解析度高，但易「拖刮」損傷樣品表面，且還會由於探針與樣品表面產生的粘滯力造成圖像失真；

非接觸模式 可以避免上述問題，但由於探針與樣品表面距離較遠、作用力太小，造成解析度降低，且可能因表面張力干涉而造成圖像變形；

輕敲模式 是一種較為先進的模式，它是採取探針垂直樣品表面高頻振動，交替的讓針尖與樣品表面「接觸」和「抬高」。這種模式結合了上述的兩種優點，既不損傷樣品表面又有較高的解析度。

1.具有高分辨能力，測試對樣品無損傷。

2.AFM利用原子間的范德華力來呈現樣品的表面特性。 因此，AFM除導電樣品外，還能觀測非導電樣品的表面結構，且不需要用導電薄膜覆蓋，其應用范圍更為廣闊。

3.具有很寬的工作范圍 ，可以在真空、空氣、常溫、低溫、高溫等環境下掃描成像。

4.樣品制備簡單 ，樣品不需要包埋、覆蓋、染色等處理，可直接觀察。

1.針尖易磨損和受污染，磨損無法修復，污染難以清洗。

2.掃描范圍小 ，容易將局部的、特殊的結果當做整體的結果分析，結果缺乏重現性。

雖以此設備為例，但設備原理均大同小異，只是精度不同，故可根據實際需求選擇。

不積珪步，無以至千里；不積細流，無以成江海。做好每一份工作，都需要堅持不懈的學習。