A. 從菠菜中提取葉綠素
通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質分離提純方法；
（2）通過薄層色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑒定的原理；
（3）從菠菜中提取出葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素等色素並加以分離。
【實驗原理】
色譜法利用混合物中各組分在某一物質中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。薄層色譜法是其中一種微量快速的分析分離方法。它具有靈敏、快速准確等優點。
薄層色譜屬於固-液吸附層析的類型。通常是把吸附劑放在玻璃板上成為一個薄層，作為固定相，以有機溶劑作為流動相。實驗時，把要分離的混合物滴在薄層板的一端，用適當的溶劑展開。當溶劑流經吸附劑時，由於各物質被吸附的強弱不同，就以不同的速率隨著溶劑移動。展開一定時間後，讓溶劑停止流動，混合物中各組分就停留在薄層板上顯示出一個個色斑的色譜圖。若各組分無色，可噴灑一定的顯色劑使之顯色（如圖）。
混合物中各物質在薄板上隨溶劑移動的相對距離稱為比移值（Rf值）。
B. 葉綠素提取實驗
一 實驗目的
1．掌握提取葉綠素的方法；
2．了解薄層層析的原理，掌握薄層層析的一般操作和定性鑒定方法
二 實驗原理
1．葉綠素提取
高等植物體內的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素(C40H56O2)等4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬於四萜類，為一長鏈共軛多烯，有α、β、γ三種異構體，其中，β異構體含量最多。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在於植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶於乙醇，在乙醚中溶解度較小。根據它們的化學特性，可將它們從植物葉片中提取出來，並通過萃取、沉澱和色譜方法將它們分離開來。
2．薄層色譜
薄層層析是快速分離和定性分析微量物質的一種極為重要的實驗技術，具有設備簡單、操作方便而快速的特點。它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上製成薄層板，將樣品溶液點加在起點處，置於層析容器中用合適的溶劑展開而達到分離的目的。用此法分離時幾乎不受溫度的影響，可採用腐蝕性顯色劑，而且可在高溫下顯色，特別適用於揮發性小或在較高溫度下易發生反應的物質，同時也常用來跟蹤有機反應或監測有機反應完成的程度。
薄層層析的器材選擇：
（1）基板：玻璃、塑料、金屬箔，常用玻璃板。
（2）吸附劑：
吸附劑要有合適的吸附力，並且必須與展開劑和被吸附物質均不起化學反應。可用作吸附劑的物質很多，常用的有硅膠和氧化鋁，由於吸附性好，適用於各類化合物的分離，應用最廣。選擇吸附劑時主要根據樣品的溶解度、酸鹼性及極性。氧化鋁一般是微鹼性吸附劑，適用於鹼性物質及中性物質的分離；而硅膠是微酸性吸附劑，適用於酸性物質及中性物質的分離。以下簡單介紹吸附劑的幾個基本參數。
種類：常用：氧化鋁（強極性）、硅膠（中強極性）
不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳
符號：H——無任何添加劑；G——加有鍛石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合劑；
F——加有熒光素（Fluorescein）
CMC——加有羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose）
例：硅膠GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑，也加有熒光素，可以在波長254nm的紫外光下激發出熒光
粒度：目：1cm2內的篩孔數，數目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細，氧化鋁為200目，硅膠為100~150目。
μ：顆粒的平均直徑，以微米表示。例如：40μ的顆粒與100目相當。
活性：
吸附劑按其含水量的多少各分為五個等級：I級含水量最少，活性最高；V級含水量最多，活性最低；但並不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級別的吸附劑，要用實驗的方法來確定。
酸鹼性：
市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、鹼性（用以分離生物鹼等鹼性化合物），其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9—10；其中以中性氧化鋁應用最廣，可用來分離各種化合物，特別是那些對酸、鹼敏感的化合物。
硅膠沒有酸鹼性之分。
（3）展開劑
在樣品組分-吸附劑-展開劑三個因素中。對一確定組分，樣品的結構和性質可看作是一不變因素，吸附劑和展開劑是可變因素。而吸附劑的種類有限，因此選擇合適的展開劑就成為解決問題的關鍵。展開劑的選擇有以下要求:
（a）對待測組分有很好的溶解度。
（b）能使待測組分與雜質分開，與基線分離。
（c）使展開後的組分斑點圓而集中，不應有拖尾現象。
（d）使待測組分的Rf值最好在0.4~0.5，如樣品中待測組分較多，Rf值則可在0.25~0.75范圈內，組分間的Rf值最好相差0.1左右。由於薄層色譜法用途非常廣泛，國內外均有現成的鋪有吸附劑的薄層板出售。一般實驗室中也可自己制備。
(e)不與組分發生化學反應，或在某些吸附劑存在下發生聚合。
(f)具有適中的沸點和較低的粘滯度。
展開劑的極性是指與樣品組分相互作用時。展開劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作用、氫鍵作用及介電作用的總和。展開劑要根據樣品的極性及溶解度，吸附劑活性等因素進行選擇，總的原則是展開劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右。常用溶劑極性次序是：石油醚<環己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。
如一種溶劑不能充分展開，可選用二元或多元溶劑系統。
4．展開槽與展開：
薄層的展開在密閉的容器即展開槽或稱為層析缸中進行。
展開：
合適的展開劑用量為浸及下端硅膠，但不浸及樣點；點樣端向下，每次只展開一塊，放在正中，以免爬斜（進而展開傾斜）。
5．顯色：
如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環的物質都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點的位置；對於在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑點），顯色後，立即用鉛筆標出斑點的位置。常用
普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素，專用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等。
三、實驗儀器與葯品
儀器：半微量玻璃儀器一箱，小燒杯，層析缸(槽)，載玻片(100mm×25mm)乾燥器，電吹風，毛細管，移液管，研缽，布氏漏斗，抽濾裝置。
試劑：硅膠，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，飽和NaCl溶液，無水Na2SO4
四、實驗步驟
1．制板：
將硅膠加 1％ CMC，調成槳狀(硅膠：CMC=1:3~4)（在平鋪玻璃板上能晃動但不能流動），將其塗在載玻片上（100mm×25mm）），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動，至平坦為止，放在干凈平坦的檯面上，晾乾之後放入105℃烘箱活化1小時，取出放入乾燥器內待用。
2、葉綠素的提取
在研缽中放入幾片(約5g)菠菜葉(新鮮的或冷凍的都可以．如果是冷凍的，解凍後包在紙中輕壓吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，適當研磨。將提取液用滴管轉移至分液漏斗中，加人10 mL飽和NaCl溶液(防止生成乳濁液)除去水溶性物質，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩次。將有機層轉入乾燥的小錐形瓶中，加2g入無水Na2SO4乾燥。乾燥後的液體傾至另—錐形瓶中(如溶液顏色太淺，可在通風櫃中適當蒸發濃縮)。
3、點樣
用一根內徑 1mm的毛細管，吸取適量提取液，輕輕地點在距薄板一端1.5cm處，平行點兩點，兩點相距1cm左右。若一次點樣不夠，可待樣品溶劑揮發後．再在原處點第二次，但點樣斑點直徑不得越過2mm。
4、展開
先在層析缸中放入展開劑[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(體積比為3:1:1)]，加蓋使缸內蒸氣飽10min， 再將薄層板斜靠於層析缸內壁。點樣端接觸展開劑但樣點不能浸沒於展開劑中，密閉層祈缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1crm時，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，晾乾或用電吹風吹乾薄層。
五、實驗注意事項
1．制板時用注意使板上硅膠厚度盡量一致。
2．植物葉片不要研成糊狀，否則會給分離造成困難
C. 某班學生以新鮮菠菜葉為材料進行葉綠體中色素的提取和分離的實驗時，由於各組操作不同，出現了如圖所示的
A、光合色素不能溶於水，甲沒有色素，可能是誤用蒸餾水做提取液和層析液專，故A正確；
B、乙中色素屬的量較少，可能是因為研磨時未加入SiO2，導致研磨不充分、提取色素含量少，故B正確；
C、丙中葉綠素含量比類胡蘿卜素含量低，可能是因為研磨時未加入CaCO3，導致部分色素被破壞，故C錯誤；
D、丁中葉綠素含量比類胡蘿卜素含量低，且色素含量較少，可能是因為研磨時未加入CaCO3，導致部分色素被破壞所致，故D正確．
故選：C．
D. 圖甲是菠菜葉肉細胞中的葉綠體亞顯微結構示意圖，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示不同的部位；圖乙是光合作用的碳反應
（1）利用新鮮菠菜葉片進行「光合色素的提取和分離」活動．在菠菜葉片研磨過程中，加入95%乙醇的作用是作為提取色素的溶劑；分離色素的過程中，應注意濾紙上的濾液細線要高於層析液的液面；分離後，在濾紙條上會呈現四條色素帶，其中離濾液細線最遠的色素是胡蘿卜素．
（2）光合色素存在於圖甲的[Ⅲ]光合膜中，其中葉綠素主要吸收紅光和藍紫光．圖乙過程發生在圖甲的[Ⅱ]葉綠體基質中．
（3）圖乙中，物質①是3-磷酸甘油酸，該物質在光反應產物ATP和NADPH的作用下形成物質②3-磷酸丙糖．若3個CO2分子進入卡爾文循環可形成6個物質②分子，其中有5個物質②3-磷酸丙糖分子經過一系列變化再生成RuBP，其餘的離開循環，可在葉綠體內作為合成澱粉、蛋白質和脂質等大分子物質的原料．
故答案為：
（1）作為提取色素的溶劑 層析液 胡蘿卜素
（2）Ⅲ光合膜 藍紫Ⅱ基質
（3）3-磷酸甘油酸 ATP和NADPH 5 澱粉
E. 求葉綠素提取的實驗步驟 求葉綠素提取的實驗步驟
葉綠素的提取
▲ 將新鮮菠菜（Spinacia）葉片洗凈擦乾,去葉柄及葉脈.稱取樣品 8g,剪碎置研缽內,加入 8cm3丙酮及少許固體碳酸鈉,迅速研磨成勻漿；然後再加入 20cm3丙酮充分研磨.
▲ 在一玻璃漏斗底部墊一小團脫脂棉,將勻漿通過脫脂棉過濾至已裝有 20cm3石油醚的分液漏斗中,再用少量的丙酮沖洗葉片殘渣及研缽,合並濾液.
▲ 沿分液漏斗的壁小心加入 40cm3蒸鎦水,輕輕搖動,使色素轉移到上面的石油醚層靜置數分鍾,待分層清楚後棄去下面的丙酮一一水層.如發生乳化現象可加入 2－3cm3飽和NaCl 溶液.
▲ 在分液漏中再加入 40cm3蒸鎦水,輕輕搖動,以洗去石油醚中殘留的丙酮,共洗兩次.然後將葉綠素的石油醚提取液放入具塞錐形瓶中,置暗處或用黑紙包好備用.
F. 如圖是「綠葉中色素的提取和分離」實驗的部分材料和用具．據圖回答下列問題：（1）圖中步驟①加入研缽內
（1）研磨時需要加入3種物質：10 mL的無水乙醇，作用是溶解色素；二氧化硅可以增大摩擦力，使細胞和葉綠體破碎；細胞研磨破碎後，會溢出有機酸，為防止葉綠素中的鎂被氫取代，破壞葉綠素，研磨時需加入少許碳酸鈣中和有機酸．
（2）過濾研磨液時，漏斗基部不能用濾紙，因為色素可吸附在濾紙上．一般用一層尼龍布過濾．
（3）剪去兩角的作用是防止兩邊色素擴散過快．畫濾液細線的要求是細、齊、直，防止色素帶重疊．
（4）層析時的關鍵技術是不能讓層析液沒及濾液細線，否則，濾液細線會被層析液溶解，不能分離．4種色素溶於層析液中，因溶解度的差異，造成在濾紙條上擴散速度不同，從而達到分離的目的．由於層析液有毒，而且可以揮發，所以要加蓋．色素帶的寬度是由各種色素含量不同造成的，含量越多，色素帶越寬，一般植物葉片中葉綠素a含量最多，所以葉綠素a帶最寬．擴散速度最快的是胡蘿卜素，在色素帶的最上層．
（5）葉綠素不穩定，易分解，而葉黃素和胡蘿卜素較穩定．
故答案為：
（1）無水乙醇二氧化硅碳酸鈣
（2）尼龍布
（3）防止色素帶不整齊細、齊、直
（4）層析液不要沒及濾液細線防止層析液揮發葉綠素a胡蘿卜素
（5）葉綠素a和葉綠素b胡蘿卜素和葉黃素