瓊脂糖凝膠電泳實驗裝置

❶ 瓊脂糖凝膠電泳槽

電泳槽可以互換使用。但是這兩種凝膠還是有很大區別的。前者，主要用來分離核酸，後者主要用來分解蛋白質大分子。因為後者的解析度更高些。
電泳的原理是一樣的，當然可以互換使用了。但是在實驗室現實操作過程中，兩者基本不混用，因為二者需要做的膠版不一樣大，需要的膠的厚度也不大一樣。跑的時間也差異很大。關鍵染色劑不一樣。所以不混用。
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❷ 瓊脂糖的電泳技術

天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約佔80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由於這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優點如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約佔98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，解析度高，重復性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳後區帶易染色，樣品極易洗脫，便於定量測定。製成干膜可長期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由於建立了超微量技術，0.1ug蛋白質就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用於分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜製作等。由於這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。
1．核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與鹼基對的對數成反比，因此通過已知大小的標准物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴於分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2．核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環 DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3．電泳方法
（1）凝膠類型
用於分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是後者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易於製作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統
缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由於電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配製成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。
TAE緩沖能力較低，後兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉澱，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配製一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配製與加樣
DNA 樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳解析度反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不宜高於5V/cm。
電泳系統的溫度對於DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低於0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，並進行有關的數據分析。 生物化學與分子生物學的研究工作經常需要對電泳分離後的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合於進行雜交操作，1975年，Southren創造了將DNA區帶原位轉移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。隨後，Alwine等將類似方法用於RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設計了將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等製成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。1982年Reinhart等用電轉移法將等電聚焦後的蛋白質區帶從凝膠轉移到特定膜上，稱Eastern印跡。
目前國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快效率高、重復性好，應用更加廣泛。聚丙烯醯胺凝膠也可用於印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用於轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。
進行印跡轉移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。 一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小於20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動方面伸直，而轉向時間與DNA分子大小關系極為密切。1983年Schwartz等人根據DNA分子彈性弛豫時間（外推為0的滯留時間）與DNA分子大小有關的特性，設計了脈沖電場梯度凝膠，交替採用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。後來Carle等改進了電泳技術，並發現周期性的反轉換電場(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統是由一水平式電泳槽和兩組獨立、彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關。
電泳時，DNA分子處在連續間隔交替的電場中。首先向S極移動，然後改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間鬆弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構型後，才能繼續前時。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區帶。交變脈沖電泳可有效分離數百萬鹼基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調，使用更加方便。
此外，瓊脂糖平板常用於免疫擴散技術的電泳技術相結合的多種免疫電泳。

❸ 十二烷基硫酸鈉-瓊脂糖凝膠電泳（SDS-AGE）與wenstern電泳的區別

凝膠電泳的實驗原理聚丙烯醯胺凝膠電泳，普遍用於分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用於分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應用較廣。瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。聚丙烯醯胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯醯胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯醯胺凝膠採用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

❹ 瓊脂糖凝膠電泳操作應注意哪些環節

瓊脂糖凝膠電泳是常用的分離和檢測方法，瓊脂是最常用的載體支持物，核酸分子具有電荷效應和分子篩效應，利用此特性可達到分離檢測的目的。一、瓊脂糖凝膠的特點天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(agarose，約佔80%)及瓊脂膠(agaropectin)組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由於這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優點如下。1.瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。2.瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大(約佔98%~99%)，近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，解析度高，重復性好。3.瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。4.電泳後區帶易染色，樣品極易洗脫，便於定量測定。製成干膜可長期保存。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由於建立了超微量技術，0.1ug蛋白質就可檢出。瓊脂糖凝膠電泳也常用於分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜製作等。由於這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系①DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與鹼基對的對數成反比，因此通過已知大小的標准物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴於分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。②瓊脂脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。表瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.12、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA(covalentlyclosedcircular，cccDNA)>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA(一般為球形)不能進入膠中，相對遷移率為0(Rm=0)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0)，由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。3、電泳方法①凝膠類型用於分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前用的是後者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易於製作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。②緩沖液系統缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢;相反，高離子強度的緩沖液由於電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配製成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。TAE緩沖能力較低，後兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉澱，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。③凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配製一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。④樣品配製與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。⑤電泳瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳解析度反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不宜高於5V/cm。電泳系統的溫度對於DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低於0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。⑥染色和拍照常用熒光染料溴乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，並進行有關的數據分析。注意事項：電泳中所使用的染料EB是致癌物質，一定要小心，避免其接觸皮膚等，進行電泳操作的時候一定要帶手套，手套要及時更換，現在也除了一些EB的替代物，如Goldview等。

❺ 凝膠電泳的應用

凝膠電泳被廣泛用於分子生物學、遺傳學和生物化學：
⒈大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）分離，也可以使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）。
⒉蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯醯胺凝膠中進行（SDS-PAGE），或者非變性凝膠電泳，或二維電泳。3.毛細管電泳
⒋酶譜法（zymography）
⒌變性梯度膠凝電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）
瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。聚丙烯醯胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯醯胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯醯胺凝膠採用垂直裝置進行電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

❻ 請問做瓊脂糖凝膠電泳用什麼儀器

Wealtec的GES或mini GES電泳槽，還需要交流轉直流的供電裝置-電泳儀（ELITE300/ELITE300 PLUS）

❼ 瓊脂糖凝膠電泳分離核酸分子的實驗步驟大體有哪幾步

首先當然是把核酸提取出來啦！
接著就是制膠了，一般都是制濃度為1%的瓊脂糖膠，比如我們做20ml的膠，就是量20ml的TBE和稱取0.2g的瓊脂糖，微波爐加熱煮至透明無亮晶晶的小點（也就是瓊脂糖全部融化完，大概煮1min），等溫度降到60℃左右（放在你的手上感覺到很燙，但是能忍受10秒鍾就行了），加入1微升的核酸染料（我們用的是北京鼎國的GoldViewTM 核酸染料，這種核酸染料毒性不大），搖勻之後倒膠，避光冷卻大概30min。
第三是點膠。把凝好的膠取出來放在有與制膠同濃度TBE緩沖液的電泳槽中，取每1微升Loading Dye（一種沉澱劑，使點膠後樣品沉到膠孔底部不浮上來）混勻5微升的核酸樣品。
四是電泳啦！電壓電流和事件看你的樣品而定吧，一般這種小膠我們是用110V、400mA跑25min就可以了。
最後當然就是在紫外凝膠成像系統看結果啦！

❽ 凝膠電泳的實驗原理

凝膠電泳（英語：Gel electrophoresis）或稱膠體電泳 是一大類技術，被科學工作者用於分離不同物理性質（如大小、形狀、等電點等）的分子。凝膠電泳通常用於分析用途，但也可以作為制備技術，在採用某些方法（如質譜(MS)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或者免疫印跡）檢測之前部分提純分子。 該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳後的凝膠中回收特定的DNA條帶,用於以後的克隆技術操作。
凝膠電泳被廣泛用於分子生物學、遺傳學和生物化學：
1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）分離，也可以使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）。
2.蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯醯胺凝膠中進行（SDS-PAGE），或者非變性凝膠電泳，或二維電泳。
3.毛細管電泳
4.酶譜法（zymography）
5.變性梯度膠凝電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）
瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。聚丙烯醯胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯醯胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯醯胺凝膠採用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決於瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難於在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決於DNA分子的大小。分離小於0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構象
DNA分子處於不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而開環雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然後電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、 電源電壓
在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段姆直媛蝕鐧階畲?所加電壓不得超過5V/cm。
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的鹼基對之間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15％。
6、 離子強度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高並明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
對於天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配製成濃縮母液,儲於室溫。

❾ 瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳

5月25日 09:54 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的製作是將乾的瓊脂糖懸浮於緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸至溶液變為澄清，注入模板後室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖之間以分子內和分子間氫鍵形成較為穩定的交聯結構，這種交聯的結構使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。市售的瓊脂糖有不同的提純等級，主要以硫酸根的含量為指標，硫酸根的含量越少，提純等級越高。
瓊脂糖凝膠可以用於蛋白質和核酸的電泳支持介質，尤其適合於核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對於蛋白質來說是比較大的，對蛋白質的阻礙作用較小，這時蛋白質分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用於一些忽略蛋白質大小而只根據蛋白質天然電荷來進行分離的電泳技術，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合於DNA、RNA分子的分離、分析，由於DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產生明顯影響。例如對於雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關，而與鹼基排列及組成無關。另外，一些低熔點的瓊脂糖（62 ~ 65 °C）可以在65 °C時熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由於瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合於管狀電泳，管狀電泳通常採用聚丙烯醯胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用於等電聚焦、免疫電泳等蛋白質電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應用得相對較少。
簡單介紹一個關於瓊脂糖凝膠電泳的實驗
CK同工酶的測定
標本採集、處理和貯存
CK同工酶檢測血清和血漿均可。在4℃可保存數天，-15℃可保存2周，若用血漿宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷凍血漿測定時，應在30℃以下融化，需反復冰融者應加還原劑——巰基乙醇以穩定酶活性，速凍及貯存於-20℃或-70℃，在有β-巰基乙醇和EGTA存在時，MM和MB可穩定數年，而BB則僅穩定半年。由於CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受標本採集時間的影響較大。
瓊脂糖凝膠電泳法
1.原理
CK分子是由M和B兩種亞單位組成的二聚體，在電泳條件下，CK-BB遷移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。電泳後進行酶促反應顯色，觀察結果。顯色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，產生肌酸(Cr)及ATP，在偶聯的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶聯的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同時NADP+還原為NADPH。在365nm觀察NADPH的熒光或用熒光光密度計掃描定量。也可用四氮唑鹽顯色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)將NADPH的氫傳遞給氯化碘代硝基四唑(INT)，使其還原成紫紅色的甲鐟，顯示CK同工酶區帶。
2.試劑
① 50mmol／L Tris-巴比妥緩沖液(pH8.0)：稱取巴比妥6.716g，Tris 1.905g，溶於蒸餾水中並稀釋到1L，電泳用。
② 30mmol／L Tris-巴比妥緩沖液(pH8.6)：稱取巴比妥1.21g，Tris 1.15g，以蒸餾水溶解並稀釋到500mL。
③ 5g／L瓊脂糖[內含14g／L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]：稱取0．5g瓊脂糖，1.4gPVP，加試劑「②」100mL隔水煮沸溶解，分裝後4℃保存。
④ 400mmol／L Bis-Tris緩沖液(內含20mmol／L醋酸鎂、4mmol／L EDTA)，pH7.0：稱取Bis-Tris 8.36g，EDTA Na2•2H2O 0.149g，加蒸餾水95ml溶解，用lmol／L醋酸調至pH7.0後，稱取醋酸鎂(含4分子水)0.429g，加入，用蒸餾水稀釋到100mL。4'C保存可用2個月，-20℃保存可用6個月。
⑤ 輔酶溶液(ADP 4mmol／L，AMP10mmol／L，NADP+4mmol／L，葡萄糖40mmol／L)：稱取ADP 17.1mg，AMP36.5mg，NADP+29.7mg，葡萄糖72.1mg，加試劑「④」9mL平衡至25℃後，用lmol／L醋酸調pH至6.4(約用lml)，在4℃保存可用半個月。
⑥ 底物顯色液甲(按兩張載玻片計)：用前於甲管中加試劑「⑤」1.5mL，己糖激酶10.5 U，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6 U。混合後置37℃水浴5min，加入PMS 0.02mg(2g／LPMS 0.01m1)。PMS須避光。在加PMS前的5min內配好底物顯色液乙，加PMS後，立即與乙液混合並覆蓋於電泳凝膠板上。
⑦ 底物顯色液乙：先配製下列試劑；
A. 450mmol幾磷酸肌酸：存4℃可用3個月。
B. 5g／L氯化碘代硝基四唑：置棕色瓶貯存，4℃可用3個月。
C. 12.5g／L瓊脂糖(含62.5mmol／L氯化鈉及35g／L聚乙烯吡咯烷酮)：稱取1.25g瓊脂糖，加入100mL蒸餾水，隔水煮沸溶解後，再加入氯化鈉262.5mg及聚乙烯毗咯烷酮3.5g，溶解後分裝，置4℃保存。
用前於乙管中加入「A」液0.2mL,「B」0.2mL，置37℃水浴2min後，加入N-乙醯半胱氨酸(NAC)20mg，或還原型谷胱甘肽10mg。用預溫至37℃的滴管吸人，隔水煮沸融化後，溫度降至37～43℃(在37～43℃的水浴箱中平衡)的「C」液1.2mL，滴管吹吸混合，使NAC溶解。
⑧ 混合底物顯色液：當乙液配成後，立即吸甲液入乙液中，混合後立即使用。在水浴箱中操作，防止瓊脂糖凝固。必要時用0.2mL蒸餾水代磷酸肌酸溶液制備對照顯色液。如作熒光法，用不含PMS及INT的甲、乙液，用蒸餾水代INT溶液。
3.操作
(1)隔水煮沸溶解試劑「③」，取1.5mL鋪於1～1.2mm厚的載玻片上。於近陰極端並行挖兩個槽，作兩份標本，或作標本與控制物。
(2)加樣5μL，80V電泳50min。
(3)合理安排配製混合底物顯色液的時間，使配製完成時電泳結束。
(4)將電泳凝膠板置塗以黑漆的鋁盒中，吸底物顯色液1.5mL鋪於凝膠板上，加蓋，待凝後置37 ℃水浴1小時。
(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小時，轉入蒸餾水中數小時，取出觀察結果或用光密度計在500nm波長下掃描定量。需要時可平推至空白卡片紙上，37℃孵箱過夜，乾片保存。或用無PMS、INT底物顯色液，37℃水箱孵育20min。
(6)再置60℃乾燥箱中20min,在紫外燈(365nm)下觀察熒光。有條件者用熒光光密度計掃描定量，激發波長360nm，發射波長460nm。
4.結果觀察
瓊脂糖凝膠電泳法的結果觀察如圖9-14所示。
5.注意事項
廣泛存在於各種組織的腺苷酸激酶(AK)催化ADP產生ATP，干擾同工酶結果的判斷。加入AMP可抑制此反應，但過量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，與AMP合用可抑制各種AK同工酶的97％。NaF與CK激活劑Mg2+可逐漸形成MgF2沉澱，所以，NaF與Mg2+分開配製，臨時混合，不影響各自的作用。電泳需較高pH，酶反應需較低pH，本法中用低離子強度，pH低於8.6的電泳緩沖液；高離子強度，pH低於6.7的基質緩沖液。當含瓊脂糖的基質顯色劑覆蓋於電泳後的凝膠板，上下凝膠中的成分相互擴散後的pH，恰為酶作用的最適pH。Bis-Tris全名為Bis(2-羥乙基)亞氨基-Tris(羥甲基)甲烷，25℃時pKa＝6.46，是CK同工酶。測定優選的緩沖劑，200mmol/L時，CK活力最大。如無Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基質緩沖液。EDTA作Ca2+的絡合劑，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力隨溫度升高而增加，直至45℃；更高溫度迅速下降，56℃時很快失活。瓊脂糖電泳法測CK同工酶，絕不能象作LDH同工酶用溫度較高的瓊脂糖基質顯色液，否則CK活力喪失。而非脫氫酶反應(Nothingdehydogenase，NDH)顯著。NDH是相當於白蛋白及β球蛋白區帶處的紫紅色區帶，與蛋白質的巰基有關，標本用量大，pH高時尤其明顯，僅四唑鹽及PMS就可與標本產生，用測NADPH熒光法可避免。本法中標本用量少，顯色時pH較低，NDH反應不明顯。CK是巰基酶，絕對需要巰基試劑活化。但巰基試劑可還原四唑鹽，N-乙醯半胱氨酸及谷胱甘肽還原四唑鹽能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合體，作為酶擴散的障礙物加入，可改善區帶分離效果。CK不穩定，對光、熱及高pH敏感，最好將及時分出的血清充C02後塞緊管口，置冰室或-30℃保存，至少可穩定半個月，及時測定更好。不主張加巰基活化劑保存。影響CK同工酶電泳與顯色的因素很多，必須同時作控制物。

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參考文獻：儀器信息網，http://www.xbmu.e.cn/k

❿ 瓊脂糖凝膠電泳具體操作步驟是什麼需要注意什麼事項

一、操作步驟：

1、電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要解析度高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯醯胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。

2、凝膠濃度

對於瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。

3、緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。

4、電壓和溫度

電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低於30℃，對於巨大的DNA電泳，溫度應該低於15℃。

5、DNA樣品的純度和狀態

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉澱可以去除多餘的鹽，用酚可以去除蛋白。

6、DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

7、Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較准確。

8、凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發波長，如果激發波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。

二、注意事項：

1、巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。

2、高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現象。

3、電泳緩沖液多次使用後，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

4、如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象。

5、變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

6、太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

(10)瓊脂糖凝膠電泳實驗裝置擴展閱讀

瓊脂糖凝膠具有網路結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決於凈電荷的性質和數量，而且還取決於分子大小，這就大大提高了分辨能力。

但由於其孔徑相比於蛋白質太大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用於核酸的研究中。

蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。

瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。