A. 紅色素的檢測方法
以辣椒為例http://scholar.ilib.cn/abstract.aspx?A=ljzz200301017
綜述辣椒紅色素的多種檢測方法，即溶解性試驗、顯色反應、分光光度測定法及薄層層析法。
辣椒紅色素是從成熟的紅辣椒中提取的一種天然紅色素，屬類胡蘿卜素類色素。其色澤鮮艷，可調出由紅到橙等不同色調。其成品多為暗紅色膏狀物，廣泛應用於水產品、肉類、糕點、色拉、罐頭、飲料等各類食品的著色。辣椒紅色素著色力強，穩定性好，原料易得，是提倡使用的天然色素之一，應用前景十分廣闊。因目前食品工業中廣泛使用的人工合成色素，多數對人體有毒副作用，故包括辣椒紅色素在內的天然色素取代合成色素則成為必然。
近年來，世界上的辣椒及其製品進出口量很大，為了控制產品質量，很多國家制定了辣椒及其製品中紅色素、黃色素限量標准。我國每年對外出口的辣椒干、辣椒粉及辣椒樹脂，對方也均都在要求檢驗其中的辣椒紅色素的含量〔1〕。本文從介紹了溶解性試驗、顯色反應、可見光譜測定方法〔1〕、分光光度測定法〔2,3]等對色素含量進行半定量分析以及薄層層析法檢測辣椒紅色素的方法。
1 鑒別試驗
溶解度試驗是指將辣椒紅色素試樣分別放入水、乙醇、甘油、植物油、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等溶劑中搖動，時間不少於30s(秒)，在5min內觀察，並與溶解度的標准分級對照。色素應不溶於水和甘油，部分溶解於乙醇(油層分離)，易溶於植物油、乙醚、丙酮、乙酸乙酯〔1，4〕。顯色反應是指在1滴色素中加2--3滴氯仿和1滴濃硫酸時，試樣應呈現深藍色〔4〕。辣椒紅色素還可以通過分光光度法測定。該法包括測定紫外可見吸收光譜和紅外吸收光譜〔5〕。紫外可見吸收光譜是取少量樣品用石油醚溶解、稀釋，以石油醚為參比，在分光光度計(島津UV--260)上測定其吸收光譜。紅外吸收光譜是將樣品製片，在紅外分光光度計(島津IR--408)上測其IR光譜。將這兩種測定結果與國標GB--10783--89比較，看其峰形與標准圖譜是否吻合，是否具有標准辣紅素的特徵吸收峰，從而說明樣品的純度。
2 含量
(1)色價〔1，6] 用1．8M硫酸溶液配製每1份中含0．3005g重鉻酸鉀和34．96g硫酸銨鈷晶體的溶液作標准比色液。在5cm見方的玻璃紙上稱取50至80mg試樣，精確至0．1mg。將紙和試樣均置100mL容量瓶中，用丙酮定容後不時搖動，萃取15min以上。用10mi移液管吸取萃出液10.0mL，移入另一100mL容量瓶中，再用丙酮定容。用濾紙過濾，棄去10--15mL初濾液。將濾液潷入吸收池，用丙酮作為空白試樣，測定460nm處的吸光度，同時測定標准比色液在460nm處的吸光度(As)，按下式計算：
可萃色素色值=丙酮萃出液在460nm處的吸光度x164xIf/試樣量(g)
其中吸收池長度和儀器校準系數(If＝0．600／As)。
萃取液的As值應為0．30--0．70。如萃出液的As>0．70，則須用丙酮稀釋至原濃度的一半。如萃出液的As<0．30，則須棄去，並用較大的試樣量重新進行萃取。
(2)半定量測定樣品中色素含量〔4〕取色素液，用丙酮適當稀釋後在459nm處測光吸收值，按下式計算出樣液中含原添加色素的g數。
樣液中原添加色素的g數＝AKV／(原色素色價x100)
式中A為光吸收值，K為稀釋倍數，V為樣品色素提取液的總體積(mL)。
(3)薄層層析法分析辣椒紅色素的成分〔4〕 溶劑萃取法提取的油狀辣椒紅色素由多種組分組成，極性大小不同，用展開劑系統可以將其分離。即將高效硅膠G板在110℃活化0．5h，將色素用丙酮稀釋，用微量毛細管點樣，點樣後薄板放在層析缸中，按上行法展開，至斑點分開時終止層析，取出薄板晾乾。計算展開系統薄層層析的Rf值。
3 質量指標分析
辣椒素含量〔1〕，殘留溶劑，砷、鉻，重金屬測定分別按GT--26、OT--32、GT--16方法測定；灰分及乾燥失重分別按GB5009．4--85、GB5009．3--85測定。
4 展望
隨著食品工業的迅速發展，許多國家對食品添加劑的研究和應用也相應達到了先進的水平。人們對物質生活的要求不再滿足於過去的溫飽型，而要求營養、衛生、色形香味俱全。現代研究表明，合成色素大都有不同程度的毒性，危害人體健康，而天然色素則是人們必須的維生素來源。辣椒紅色素作為一種天然色素，可廣泛應用在食品工業中，但為了控制產品質量，許多國家對其進行限量，因此，辣椒紅色素色價及其他指標的測定是必不可少的。文中所述為目前常用的辣椒紅色素的檢測方法。溶解性試驗和顯色反應反映該色素是否油溶性類胡卜色素，可見光譜則測定最大光吸收范圍，薄層層析法測分析其基本組分。可見光譜法鑒別辣椒紅色素需要和溶解性試驗、顯色反應、薄層層析法結合使用才能保證准確性，但是該種方法對辣椒紅色素進行半定量測定的結果比較准確。用分光光度計法測定的辣椒紅色素實際是胡蘿卜色素的混合物，測定的色值稱之為總色值，或粗色值〔7〕。針對這些方法中存在的不足，還需研究者的努力工作，在此基礎上探索更簡便、更快速、更准確的檢測方法。
B. 從紅辣椒中提取紅色素實驗點樣時應注意什麼
點樣時，毛細管垂直輕輕點在原點標記上。毛細管在板上接觸時間不宜過長，一般點樣直徑在2~3mm左右，若毛細管直徑過粗，則樣直徑過大，影響色譜分離效果。
C. 實驗室怎樣從辣椒中提取辣紅素
幾種典型的辣椒色素提取精製方法
1.1 有機溶劑萃取法
根據辣椒色素的理化性質,工業上多採取以下方法進行提取:將茄科植物辣椒的成熟乾燥果實之果皮粉碎後,用乙醇、丙酮、異丙醇或正己烷等抽提。考慮到天然紅辣椒中含有辣椒紅、辣椒素、辣椒油脂等成分,其中辣椒素即辣椒鹼有辣味,高溫下產生刺激性蒸氣,因此在辣椒色素的精製過程中必須將其去除。從結構上看辣椒素含有醯胺鍵,分子中含有一個羥基,是一個極性化合物,其晶體呈現為單斜稜柱體或矩形,熔點61℃,溶於稀乙醇、己醚、丙酮、乙酸乙酯等溶劑及鹼性水溶液中。考慮到辣椒紅混合物和辣椒素在不同溶劑中溶解度不同,可以利用兩者的溶解度差異進行脫辣處理。賀文智等[5]基於此原理採用正己烷萃取法,利用辣椒紅色素易於溶於正己烷而辣椒素較難溶於正己烷的性質將兩者進行分離,操作步驟如下:稱取經去蒂、去籽、粉碎處理後的紅辣椒粉末,以丙酮為萃取劑進行常壓萃取操作,提取液在溫度為90℃、真空度為0.09MPa的條件下進行減壓蒸餾濃縮,同時回收丙酮。用丙酮提取辣椒紅的過程實質上是液固之間通過相際接觸表面進行的傳質過程,傳質速率的快慢決定著傳質設備的尺寸及操作時間。該方法為了提高傳質速率,採用索氏提取器對粉末狀的干紅辣椒進行提取。稱取一定量的經濃縮的辣椒紅粗產品用一定量的正己烷進行萃取脫辣,試驗結果見表1。
色價定義為單位質量原料的提取物的吸光度。
該方法操作簡單,色素回收率較大,產品得率高,但產品色價較小。由於色價值與辣度呈負相關性,說明該方法脫辣不夠徹底,對於以辣椒紅為主要產品且對辣椒素含量要求不是十分苛刻的情況,可以採用此方法。張宗恩等以丙酮為溶劑提取制備辣椒油樹脂,油樹脂得率高、色價大、辣素含量低,便於分離。採用pH值大於10.37的丙酮(50%)溶液進行5次以上脫辣萃取可得到口嘗無辣味的紅色素。該方法工藝簡單、操作方便,所得色素的各項質量指標均符合FAO/WHO標准。
1.2 柱層析法據報道,辣椒中的辣椒素即使稀釋1:100000仍能感覺到辣味,這在很大程度上限制了辣椒色素的應用。因此,去掉辣味成分就成為提取分離辣椒紅色素工藝的關鍵步驟。用硅膠柱層析分離辣椒色素屬分配層析法,是根據色素和辣素的結構差異,在束縛於硅膠上的固定相和洗脫液中的溶解度不同,因此在固定相和洗脫液之間的分配系數不同而達到分離效果。袁慶雲研究了用硅膠柱層析分離辣椒紅色素,總結出以下工藝流程:
辣椒→挑選→粉碎→加酶→過濾→濃縮→乙醇石油醚提取→過濾→濃縮→上硅膠柱→洗脫→濃縮→得深紅色粘稠液體。
操作要領有:
1)加酶:加酶水解使細胞中與蛋白質、脂肪、糖類等結合的色素游離出來,便於用溶劑提取。
2)提取:以90%乙醇和石油醚(1∶1)的提取液在室溫下攪拌過夜提取,經過濾後減壓濃縮。3)通過薄層層析尋找洗脫條件,當石油醚和食用級90%乙醇體積比=2∶1時展層效果最好。
4)將提取的濃縮液上硅膠柱,柱直徑10cm,高100cm,用洗脫液洗脫,收集紅色洗脫部分
5)將收集的洗脫部分減壓濃縮。
實驗所得紅色粘稠液經檢驗水分含量0.37%,脂肪含量90.68%,色素∶色階E1%1cm(475nm)=143,不含辣椒素。賀文智、索全伶等[5]也探討了辣椒紅色素的柱層析提取精製方法:用丙酮作萃取劑從紅辣椒乾粉中提取出辣椒紅粗品,粗品經減壓蒸餾濃縮處理後進行柱層析脫辣精製操作。該試驗鑒於柱層析法的優點,採用尺寸規格較大的玻璃柱進行柱層析分離,選用粒徑74～152μm硅膠作填料,石油醚與丙酮的復配混合液(10:1)為展開劑進行柱層析。辣椒紅粗品上柱淋洗分離,首先流出的是橙黃色液體(量少),其次是辣椒紅色素,最後是較難洗脫的淡黃色且具有較濃辣味的液體。收集紅色素產品進行減壓蒸餾濃縮,用751分光光度計測定其色價E1%1cm(460nm)=56.5,色素回收率可達平均67.2%。
針對現有文獻中大多介紹以紅辣椒為原料提取無辣味混合色素的方法但未對混合色素作進一步分離分析的問題,提出了採用柱層析對辣椒色素中的黃色素進行分離。該方法以硅膠為固定相,丙酮、95%乙醇分別作為辣紅素和辣黃素的洗脫劑,每次分離的色素量為硅膠質量的4%～2%,分離後的液體經減壓蒸餾得濃縮產物。通過此過程,不但可得到辣椒色素中的主要副產品———黃色素,而且相應地提高了主要成分的純度,得到純度較高的紅色素。
採用柱層析分離技術,選用吸附劑X和混合洗脫液用於中試,將辣椒色素中紅、橙、黃進一步分離,可以使低質量辣椒紅色素的色價和色調得到較大的提高。吳明光等採用柱層析分離技術,從辣椒果皮中分離出了游離型結晶辣椒紅色素單體,其含量大於95%,這是我國辣椒紅色素在劑型上的突破。
1.3 超臨界CO2流體萃取技術
由於辣椒紅素的油狀特性使得採用有機溶劑萃取分離得到的辣椒色素產品中有較高的溶劑殘留,採取一般的洗脫劑方法產品很難達到聯合國糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO,1984)規定的最新標准,極大地影響了辣椒色素的實用和出口創匯。超臨界流體萃取是一種新型的化工分離技術。該技術的關鍵是了解超臨界流體的溶解能力及隨諸多因素影響的變化規律。超臨界CO2流體萃取(SCFE-CO2)就是使用高於臨界溫度、臨界壓力的CO2流體作為溶媒的萃取過程。處於臨界點附近的流體不僅對物質具有極高的溶解能力,而且物質的溶解度會隨體系的壓力或溫度的變化而變化,從而通過調節體系的壓力或溫度就可以方便地進行選擇性地萃取分離不同物質。超臨界分離技術工藝簡單,能耗低,萃取溶劑無毒、易回收,所得產品具有極高的純度,殘留溶劑符合FAO/WHO要求。趙亞平等採用自行設計的超臨界CO2流體萃取設備進行辣椒色素提取。該設備主要由供氣系統、超臨界CO2流體發生系統、萃取分離系統、計量系統4部分組成,所有部件都國產化。實驗表明,最佳萃取條件為粒度<1.2mm,萃取壓力15MPa,萃取溫度50℃,流量6m3/h。在萃取過程中,根據UV3000紫外可見分光光度計測定200～600nm的吸光度曲線判斷辣椒色素與辣椒素的分離效果。用色素的丙酮溶液在449nm處測定吸光度,所得值即為色素的色價。從表2可以看出,用該方法萃取的辣椒色素各項質量指標均超過國家標准。
採用瑞士NOVA公司製造的超臨界萃取裝置對辣椒色素進行分離、提純。使產品符合FAO/WHO殘留溶劑標准要求(己烷含量≤25mg/kg)的最佳工藝參數是:萃取壓力18MPa,萃取溫度25℃,萃取劑流量2.0L/min,萃取時間3h。在最佳工藝條件下產品色價可達到342。韓玉謙等採用超臨界CO2流體萃取技術對色價100～180,溶劑殘留30×10-6～150×10-6的辣椒紅色素進行精製,實驗結果表明:當萃取壓力控制在20MPa以下時,辣椒紅色素的色價和色調幾乎不受損失,有機溶劑的殘留可以降低到2.7×10-6左右,但辣椒色素中的紅色系色素和黃色系色素未達到完全分離。研究發現,在超臨界CO2流體萃取辣椒色素的過程中使用助溶劑如1%的乙醇或丙酮或升高提取壓力能提高辣椒色素得率。在較低壓力下分離得到的辣椒色素幾乎都是β-胡蘿卜素,而在較高壓力下得到較大比例的紅色類胡蘿卜素如辣椒紅色素、辣椒玉紅素、玉米黃質、β-隱黃質等和少量的β-胡蘿卜素。在兩步分段提取過程中,第一階段採用分離紅辣椒油和β-胡蘿卜素的技術保證了第二階段辣椒色素提取的富集,並使辣椒紅、黃色素比率達到1.8。在自行開發的多功能超臨界CO2流體萃取分餾裝置上對辣椒色素脫辣精製技術進行了研究,結果表明:在小於10.0MPa壓力下可萃取出黃色和辣味成分,保留紅色素;當壓力大於12.0MPa時可將紅色組分萃取完全。盡管超臨界流體萃取天然色素具有很多的優點,但由於超臨界設備一次性投資較大,目前我國在這一領域還未得到廣泛的應用。
1.4 其它
採用兩步法萃取分離紅辣椒,即先用有機溶劑浸取法從干尖辣椒中萃取出含有紅色素、辣椒素和焦油味臭味的辣椒浸膏,然後再用超臨界CO2萃取的方法去除焦油味臭味並把紅色素和辣椒素分開,從而得到不含有機溶劑的紅色素和辣椒素,產量較單純用超臨界萃取方法提高5～7倍,且質量遠超過FAO/WHO(1984)標准。姚祖鳳、姜洪傑等以6種分離、提取方法進行了54次實驗,通過這些實驗了解到:辣椒紅色素的得率和質量與生產技術和工藝條件有著密切的關系。通過對比分析,可以比較這6種生產技術的先進性和實用性。6種工藝的基本情況見表3。
D. 辣椒紅色素的提取方法有哪些各有什麼優缺點
1、 油溶法
油溶法是在常溫下用呈液狀的食用油( 如棉籽
油、豆油、菜籽油等) 浸漬辣椒果皮或干辣椒粉, 使
辣椒紅色素溶解在食用油中, 然後通過一定的方法
從油中提取出辣椒紅素的一種方法[8]。
工藝流程: 辣椒→浸提→蒸餾→辣椒油樹脂→
水解→ 過濾→ 固型物→ 浸泡→ 減壓過濾→ 提取
液→減壓蒸餾→濃縮精製色素→烘乾→粉末狀辣
椒色素。
用油溶法提取辣椒紅色素時, 油與色素的分離
較困難,使得辣椒紅色素物質提取率低,難以得到色
價高的產品,現已基本停止使用。
2、溶劑法
這是辣椒紅色素的常規生產方法: 將去除壞
椒、梗、籽的干辣椒磨成粉後, 用有機溶劑( 如丙酮、
乙醚、氯仿、三氯乙烷、正己烷等) 進行浸提, 將浸提
液濃縮得到初辣椒油樹脂, 減壓蒸餾得產品[9]。
工藝流程: 辣椒粉末→有機溶劑提取→減壓回
收溶劑→油狀紅色素→有機溶劑萃取→減壓回收
溶劑→產品
採用有機溶劑提取辣椒紅素有四種方法: 浸漬
法、滲漉法、迴流提取法、索氏提取法。
目前國內外生產辣椒紅色素的廠家絕大多數
都採用溶劑法提取, 但以上各種提取方法無論採用
那種生產,在提取前均需將辣椒粉碾成粉末,操作費
用較高。此外, 由於提取後的殘渣中還殘留有相當
量的紅色素[10], 所得出品的雜質含量高,精製費用昂
貴,殘渣的可利用性差,給生產帶來困難。伍明等談
到在天然辣椒紅色素的提取新工藝時, 提到採用熱
逆流法提取辣椒紅色素的新工藝[11]。
工藝流程:辣椒干→去籽切碎→提取辣味素→除
辣→提取紅色素→減壓濃縮→真空乾燥→紅色素
↓
殘渣深加工→副產品
其優點主要表現在三個方面: 1) 提取時間短,
溶劑用量少, 收率高, 色價高; 2) 原料在提取前不需
要粉碎成粉末, 操作費用降低, 殘渣的利用價值大。
目前已開發出附加值高的系列產品。另外, 避免了
由於過分破壞植物細胞壁, 而造成一些分子量較大
的組分被浸取出來的缺點[12]。本工藝集過濾、提取、
濃縮與一體, 因而設備投資和操作費用相對較低;
3) 利用本工藝提取紅色素可以一次得到成品, 產品
無須精製, 各項指標均符合有關標准。
總之, 本工藝具有較高的應用價值, 由於所用
設備與目前通用的溶劑法提取辣椒紅色素的設備
接近, 故也為生產廠家的工藝改造提供了一種理想
的途徑。
3、 超臨界CO2 流體萃取法
超臨界CO2 流體萃取就是使用高於臨界溫度、
臨界壓力的CO2 流體作為溶媒的萃取過程。超臨界
流體萃取是一種新型的化工分離技術, 關鍵是了解
超臨界流體的溶解能力及隨諸多因素影響的變化
規律。此技術工藝簡單, 能耗低, 萃取溶劑無毒、易
回收, 所得產品具有極高的純度, 殘留溶劑符合FA
O/WHO 要求。
萃取法製得的色素多為混合色素,方法簡便,成
本相對較低, 色價高, 已成為國內外通用的制備工
藝。本法是一種先進的提取方法, 但還有待於進一
步完善。
4、 硅膠柱層析法
硅膠柱層析分離辣椒色素屬分配層析法, 是根
據色素和辣素的結構差異在束縛與硅膠上的固定
相和洗脫液中的溶解度不同, 因此在固定相和洗脫
液之間的分配系數不同而達到分離效果。這個操作
簡單, 設備條件要求不高, 分離效果很好, 去除辣味
完全。此柱洗脫液為石油醚: 乙醇( 90%) =2∶1 混合溶
劑。
內蒙古工業大學提取紅色素時, 其柱層析法采
用100 ～200 目硅膠為填料, 石油醚與丙酮( 體積比
為10∶1) , 復合液為洗脫液; 色素回收率為67.2%, 而
且色價較高為65; 可以形成橙黃、紅色與淡黃色三
條帶, 有利於紅辣椒中有效成分的精細分離。
袁慶雲用硅膠柱層析分離辣椒紅色素[13], 方法
為: 成熟的干辣椒經酶處理後用乙醇和石油醚混合
溶劑提取。提取物通過硅膠柱層析分離, 得到無辣
味的紅色素, 再經真空濃縮成粘稠狀。得到的紅色
粘稠液, 經貴州省葯品檢驗水分含量0.37%, 脂肪含
量90.68%, 色素: 色價為143, 不含辣素。
層析法雖然可製得多種色價的產品, 如呈紫紅
色的辣椒紅色素和呈橙紅色的辣椒玉紅素分開, 但
操作費用高, 工藝復雜且難度大。
5、薄層色譜
薄層色譜法分離迅速, 效率高, 靈敏度高, 而且
可用於制備和定量分析, 許多天然色素都可用薄層
色譜進行分析。陳連之等人[14]用20320 硅膠( 上海海
洋化工研究所) 自製板, 在石油醚∶丙酮=10∶1 的展開
劑中, 上行15 分鍾得TLC 色譜圖。主要黃色素成分
集中在黃1～黃3, 主要紅色素成分集中在紅1～紅
3, 並得Rf( 黃1) 為0.86, Rf( 紅1) 為0.46。
6、 溶劑微波提取法
微波是電磁波的一種, 其波長從1mm～lm, 因其
波長介於短波和遠紅外之間, 故稱微波。作為一種
高頻電磁波, 微波對處於微波場下的物質發生作
用, 物質中的分子在電場作用下可被電離而極化,
形成極化分子, 極化分子具有正負二極, 它們在電
場中產生定向排列。物料內的極化分子隨著微波電
磁場的交替變化, 發生高頻振盪。分子運動產生熱
量, 這就是微波爐加熱的原理。將微波應用於提取,
其對物質的作用表現在: 當被提取物和溶媒共同處
於微波場下時, 目標組份分子受到高頻電磁波的作
用, 產生劇烈振盪, 分子本身獲得了巨大的能量( 即
活化能) 以掙脫周邊環境的束縛, 當環境存在一定
濃度差時, 可以在非常短的時間內實現分子自內向
外的遷移達到一個平衡點。這就是微波可以在短時
間內實現提取目的的原因。
微波提取技術應用於中葯有效成分的提取, 可
以克服傳統提取方法本身固有的種種缺陷, 表現出
良好的發展前景和巨大的應用潛力。與傳統提取方
法相比, 微波提取可以縮短生產時間, 降低能源溶
劑的消耗, 同時可以提高收率和提取物純度。它的
優越性不僅在於降低設備投資和運行費用, 而且也
符合環境保護的要求。
7、超聲波溶劑提取法
此方法在提取過程中, 通過產生強烈的振動,
空化, 攪拌, 從辣椒粉中提取出辣椒紅色素。與傳統
的提取方法比較, 此法具有收率高, 生產周期短, 無
需加熱, 有效成分不破壞等優點。
8、 酶法提取
周旭章等研究提出醇提辣一酶脫脂二步法精
制辣椒紅色素粗製品的新工藝。脫辣最佳工藝條
件: 溫度為室溫; 脫辣劑( 乙醇) 濃度70% ; 投料比1:
2.5 ～1: 3; 萃取次數3 ～4 次。脫脂最佳工藝條件為
pH 8 室溫, 脫脂劑(Mix 酶) 濃度10 ～15 mg/L, 反應
時間50min。邵學軍等研究不同濃度NaOH 溶液浸
泡辣椒粉脫辣效果, 試驗結果認為, 用NaOH 溶液攫
泡辣椒粉脫除辣素的最佳操作條件為辣椒粉( g) 與
15%NaOH 溶液(m1) 之比為1:9, 90℃浸泡1.5 h。