1. 建立一個蛋白分離純化實驗室需要什麼設備
基本設備需要有搖床，發酵罐，低溫搖床，純水機，乾燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，高壓均質機，超聲波破碎儀，高速冷凍離心機，蛋白質分離純化系統（簡易的可以的用蠕動泵加核酸蛋白檢測儀，高級的可以用AKTA），各種規格的層析柱，各種型號的層析填料，冰箱（4度，-20度，-80度），電子天平，精密電子天平，磁力攪拌器加攪拌子等，電導率儀，pH計，移液器。
如果不做發酵表達的話可以省略搖床，發酵罐，低溫搖床。
2. Western blot實驗需要准備什麼試劑和耗材
1.1細胞
①將細胞培養皿置於冰上，用冰冷得PBS洗滌細胞2次
②吸出PBS，加入裂解液（碧雲天P0013；1%TritonX-100；）
a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。
b.對於貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒後，細胞就會被裂解。（一般10*7個細胞用100ul裂解後獲得的上清蛋白濃度約為2-4mg/ml）
③用刮刀刮下貼壁細胞，轉移至EP管，14000rpm離心5分鍾
④將上清液轉移至EP管，負20℃保存
1.2組織
①將組織樣品剪成細小碎片（最好在冰上進行）
②加入裂解液
a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。
c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)
d.用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果組織樣品本身細小，可適當剪切後直接加入裂解液，通過強烈渦旋使樣品裂解充分
（每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解後獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態的不同組織有所不同）
③充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鍾，取上清
2. 蛋白定量（Thermo UF289356)
2.1稀釋白蛋白(BSA)標准液的制備
2.2 制備BCA工作液（A液：B液=50：1 密閉室溫可以保存一段時間）
總體積=（#標准孔+#未知孔）*#復孔*每個樣本的體積
測試管每管2ml;96孔板每孔200ul。
2.3 濃度測定
①將25ul標准液和樣本設置復孔加入96孔板，按照樣本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果樣本有限就加10ul比例用1：20；推薦每個待測的樣本做2-3個平行反應；根據樣品的濃度，可提前稀釋5-10倍)
②最好搖勻30秒，將96孔板在37℃孵育30min
③冷卻至室溫，酶標儀設置為562nm，在5分鍾內測試完所有的樣本。
④所有的樣本減去空白對照在562nm處的吸光度，繪制標准曲線，確定樣本的濃度
3. 蛋白電泳
3.1 變性以及還原蛋白
在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸。
3.1.1室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合。
3.1.2 100℃或沸水浴加熱10分鍾，以充分變性蛋白
3.1.3 冰上驟冷，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可
3.1.4通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近則可以停止電泳
4. SDS-PAGE凝膠電泳
4.1 膠的選擇與制備（根據目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）
4.2 配膠（碧雲天P0012AC）
洗干凈玻璃板，裝板加水驗漏後，晾乾裝到制膠架上。根據配方配膠。
（配膠順序：先配分離膠（下層膠），充分凝固後，再配濃縮膠（上層膠））
4.2.2 配製濃縮膠（上層膠）
4.2.3 組裝制膠器
①將制備好的分離膠灌入制膠板內（緩慢不要有氣泡），隨後緩慢加入適量異丙醇壓平分離膠。
②20-30分鍾分離膠凝聚完成，傾斜板，倒掉異丙醇，吸水紙吸去殘余液體，棄去上層壓膠的水或醇。
③加入配好的濃縮膠灌入制膠板內，然後插上梳子，20-30分鍾濃縮膠即可凝聚。
④緩慢取出梳子，上樣。
4.2.4 上樣及電泳
①蛋白冰上溶解，調整蛋白濃度，和等體積5×上樣緩沖液混合，即為上樣液。用純水沖洗膠板，放入電泳槽
②兩塊板之間倒入電泳液，確認無漏液
③迅速拔出梳子，用槍輕輕吹孔使碎片沖出
④依次加入蛋白marker和蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預染的marker.加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恆壓電泳，約30min,當指示劑溴酚藍進入分離膠後改用90V恆壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0.5cm處時關閉電源，取出膠板。（上樣時間盡量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）
⑤調節電泳的電壓和時間，傳統膠是上層膠80V，30min;下層膠120V 90-120min.
(為了防止蛋白條帶再凝膠上擴散，電泳後應盡快轉膜)
5. 轉膜
將蛋白凝膠中的蛋白，通過電流作用轉移到轉印膜上。由於蛋白凝膠本身易碎，蛋白條帶容易子啊凝膠中擴散，而且抗體也不易於進入凝膠中與目的蛋白結合，所以需要在轉印膜這樣的固相載體上實現後續封閉、洗滌，顯色等實驗操作。
5.1 轉膜
①將減好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上，然後用dd H2O漂洗2min,浸泡於轉移緩沖液中5min後開始後續操作
②裝配轉膜三明治結構（在轉移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產生）
黑面（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然後將三明治轉移至電泳槽中，黑面對黑面。
3. （Bradford法）如何測定蛋白濃度
考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白質濃度
1、試劑：
（1）考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G—250 100mg溶於50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml, 濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）標准蛋白質溶液：
純的牛血清血蛋白，根據其純度同0.15mol/L NaCl配製成100 ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器
3、標准曲線的製作
試管編號 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml標准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考馬斯亮藍試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
搖勻，1h內以0號管為空白對照,在595nm處比色
A595nm
以A595nm為縱坐標，標准蛋白含量為橫坐標（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標軸上繪制標准曲線。
4、樣品中蛋白質含量的測定
另取兩支幹凈的試管（做一重復），加入合適濃度的待測樣品，使其測定值在標准曲線的范圍內，測定方法同上，由樣品液的吸光度查標准曲線即可求出含量。
注意事項：
1、 如果要求嚴格，最好在試劑加入後的5~20min內測定光 吸收，因為這段時間內顏色是最穩定的。
2、 若選擇在旋渦混合器上混合，注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難於消除。