配置缓冲液实验装置

『壹』 聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验材料

一．设备
进行凝胶电泳的装置见图版4。
1）直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器（硅或硒整流器），调压范围0—300伏。
2）电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳 管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部钻孔。插入电泳管，用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长10厘米，内径 ^5毫米。脱色用玻璃管长10厘米，内径8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。
3）凝胶管架灌装凝胶管时使管保持垂直位置，用有机玻璃制成。
二．操作方法
1）凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝胶溶液（方法见下文）。每管加至液体高度为7．5厘米。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地加一层（高约1厘米）蒸馏水于表面上，勿使与凝胶液混合，室温放置。如果条件合适溶液于 30—60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重结晶）25克，双体（甲醇重结晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要时用三羟甲基氨基甲烷调pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羟甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析纯0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚剂以延缓凝聚时间。使操作方便，如凝聚时间已足够长可以用蒸馏水代替。溶液丁：过硫酸铵（二级）2．8克加水至 100毫升新配。必要时用氨水调pH至7．0 c， 溶液甲及乙配后可在冰箱中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。
2）准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中，在上下两槽内分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中，管下端勿留气泡。血清电泳可以用巴比妥缓冲液pH一8．6，离子强度0．05（配法：巴比妥钠10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，温热使溶。加硫柳汞0．1克防霉）。
3）加样在资料介绍的方法中，一般还在了这一步。在血清样品中加入少量蔗糖以增加密度，用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上，加样量一般为7微升血清。如果在样品中混入少量溴酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。
4）电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1一2小时。电泳完毕取下凝胶管，用细长针头沿管壁注蒸馏水，使凝胶与管壁剥开。然后用橡皮球压出凝胶条。
5）染色及脱色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中（图2）。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脱色时电场强度25伏/厘米，电流10—1 5毫安/管。3—4小时脱色完毕。增高电压可以加速脱色。有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。
6）保存与记录脱色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然干燥后保存，在需要观察时再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。
三、实验结果
1．电泳条件的选择
为了选择血清蛋白电泳较合适的条件，我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙腈的浓度、过硫酸铵的浓度等条件进行了试验。根据以上试验结果，我们在分离血清蛋白时选用的条件是：单体浓度6.25-6.5%，双体占总丙烯酰胺量的4—5%，正离子采用三羟甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及过硫酸铵浓度分别为0.25%及0.7%。电泳电压以7—10伏/厘米较为合适。但电泳时间较长，约2—3小时，室温低时可以电压稍高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。
2．人血清及其酒精分划部分的凝胶电泳
采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15—20条区带。我们也根据RaFmand介绍的两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电泳上的a：区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d，区带的一部分则与凝胶电泳中自蛋白区带相重合。二种电泳方法所得的图谱见图版9。在正常人血清中后白蛋白（PA）、转铁蛋白(Tr）和触珠蛋白（HP）均有不同的型， 一例骨髓瘤病人血清的和凝胶电泳自由电泳图谱的比较见图版11、12。我们也比较了酒精分划人血浆各部分的纸电泳和凝胶电泳图谱，结果见图版13。从图中可见在纸上电泳检定时看来较纯晦白蛋白和丙种球蛋白部分，在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。
3．放射病狗血清蛋白电泳的观察 放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资 料。正常狗血清的凝胶电泳图谱大致与人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 显变化，至极期时则可以观察到鸭、Tr、融及 sp等区带有明显增高。我们用胎3—10型光 谱仪用光密度计将电泳图谱进行了扫描，所得 结果见图3，图版14。由于仪器的限制光缝 最小只能达到0．5毫米，从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况，这 远比纸电泳中所见更为明显。我们认为如果联 系临床表现对变化的本质进行一些研究，将有 助于了解放射病极期来到前后体内蛋白质代谢的一些情况。
4．在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳 观察 用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上的蛋白质区带（见图版14）。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上，在37c’温箱中保温2—3小时，再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上，可以看到乳白色本底上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化的情况。
四、结 论
本文介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的一些初步实验条件和实验结果，并与纸电泳、自由电泳等进行了对比。从结果中可以看到聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强，重演性良好。它在临床生化分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有较广泛应用的可能性。

『贰』 某科研小组为探究植物光合作用速率的变化情况，设计了由透明的玻璃罩构成的小室（如图A所示）．（1）将该

（1）影响光合作用的因素主要有光照强度、温度、二氧化碳浓度等．图A是密闭装置，内有二氧化碳缓冲液，说明实验过程中二氧化碳浓度始终不变，那么影响小室内植物光合作用速率变化的主要环境因素就只有光照强度和温度了．装置刻度管中液滴移动是由氧气的增减造成的，只在有氧气释放，液滴就会右移．图B中g点表示光合作用与呼吸作用相等，超过该点将消耗氧气，所以g点时储存氧气最多．
（2）表格中数据表明，氧气的产生速率在逐渐减小，在B曲线上所对应的区段是de和fg．
（3）d点与c点相比，d点的氧气释放速率快，即光合速率快，消耗的C₃多，那么C₃的生成量就多，暗反应发生在叶绿体基质中．
（4）用装置A测定的光合作用的速率比实际值偏低，原因是植物进行呼吸作用消耗了部分氧气．如果要测定该植物真正光合作用的速率，还需要测定出呼吸速率，具体做法是设置A装置完全相同的C装置，将C装置遮光放在与A相同的环境条件下．测得单位时间内，实验组读数为M，对照组读数为N，该植物真正光合作用的速率是=净光合速率+呼吸作用速率=M-N或M+|N|．
故答案为：
（1）光照强度、温度18（或g）
（2）de或fg
（3）多叶绿体基质
（4）植物存在呼吸作用遮光M-N（M+|N|）

『叁』 为探究CO2浓度和光照强度对植物光合作用的影响，某兴趣小组设计了如图所示的实验装置若干组，利用缓冲液

A、组别1中没有光照，液滴向左移2.24代表的是植物的呼吸作用，消耗了密闭小室内的氧气，由于室温维持在25℃，其他组别的呼吸作用保持不变，A正确；
B、组别6中在光照强度1500，CO₂浓度0.03时，既进行光合作用又进行呼吸作用，液滴向右移动9.00，植物光合作用产生氧气量大于有氧呼吸消耗氧气量，B错误；
C、组别2和3相比，CO₂浓度0.03时，光照强度分别是800和1000，限制液滴移动的主要环境因素是光照强度，C正确；
D、组别3和4相比，光照强度1000，CO₂浓度分别是0.03和0.05，限制液滴移动的主要环境因素是CO₂浓度，D正确．
故选：B．

『肆』 图乙为利用图甲实验装置测得植物B叶片在不同光照强度下某种气体体积变化曲线图．（1）本实验所测量的气体

（1）分析实验装置可知，装置中设置的CO₂缓冲液能够为叶片光合作用提供二氧化碳，因此装置中气体量的变化是氧气量的变化．乙图中可以看出，4klx的光照时光合作用大于呼吸作用，甲装置中的氧气增多，因此红色液滴应该向右移动．P点时光照强度为0，叶片只进行呼吸作用，影响呼吸作用的主要外界因素是温度．光照强度为8klx时，叶片达到光饱和点，对应的净光合作用强度为8ml/h，图中呼吸作用强度为4ml/h，因此1小时光合作用产生的气体量为12毫升．
（2）表格中可以看出，随着时间的推移，游离型的叶绿素含量升高，结合型的叶绿素含量降低，因此导致植物B叶片光合速率下降的主要原因是结合型叶绿素含量降低．在提取色素的过程中，为了研磨充分需加石英砂，为了防止色素被破坏需加入碳酸钙，再利用酒精提取色素．色素只有在和类囊体相似的环境中才能产生氧气，因此提取出来的色素在试管中不能产生氧气．
故答案为：
（1）氧气右温度12
（2）结合型叶绿素含量降低石英砂、碳酸钙、酒精不变

『伍』 图甲为测定光合作用速率的装置，在密封的试管内放一新鲜叶片和二氧化碳缓冲液，试管内气体体积的变化可根

（1）二氧化碳缓冲溶液可维持甲中二氧化碳浓度的相对稳定，因此液滴的移动方向取决于甲中氧气量的变化，由于光照强度由5渐变为2.5 千勒克斯时，呼吸作用速率等于光合作用速率，因此液滴不移动．
（2）对叶片来说，当光照强度为10千勒克斯时，光合强度大于呼吸强度，应图丙中不存在的箭头有ef．
（3）在图乙中，为了获得图乙中-50mL/h的数据，则应对甲装置进行改进，新装置为把甲装置中的二氧化缓冲液改为氢氧化钠溶液，其他条件不变，测定呼吸作用应在黑暗条件下进行实验．
（4）丁图中在15℃时光照下二氧化碳的吸收量为2.5，呼吸作用释放的二氧化碳为1，由于实线表示的是净光合速率，因此总光合速率=净光合速率+呼吸速率=3.5，因此光合作用制造的有机物量是呼吸消耗有机物量的3.5倍．
（5）丙图中由同一个细胞产生的葡萄糖彻底氧化分解利用，从叶绿体到线粒体会穿过4层膜，丙图表示某植物的部分细胞结构和相关代谢情况，a～f代表O₂或CO₂，图中c，d不可以表示ATP的去向，原因是叶绿体产生的ATP仅供暗反应利用．
故答案为：
（1）原始
（2）ef
（3）把甲装置中的二氧化缓冲液改为氢氧化钠溶液，其他条件不变 黑暗或遮光
（4）3.5
（5）4 叶绿体产生的ATP仅供暗反应利用