A. 红色素的检测方法
以辣椒为例http://scholar.ilib.cn/abstract.aspx?A=ljzz200301017
综述辣椒红色素的多种检测方法，即溶解性试验、显色反应、分光光度测定法及薄层层析法。
辣椒红色素是从成熟的红辣椒中提取的一种天然红色素，属类胡萝卜素类色素。其色泽鲜艳，可调出由红到橙等不同色调。其成品多为暗红色膏状物，广泛应用于水产品、肉类、糕点、色拉、罐头、饮料等各类食品的着色。辣椒红色素着色力强，稳定性好，原料易得，是提倡使用的天然色素之一，应用前景十分广阔。因目前食品工业中广泛使用的人工合成色素，多数对人体有毒副作用，故包括辣椒红色素在内的天然色素取代合成色素则成为必然。
近年来，世界上的辣椒及其制品进出口量很大，为了控制产品质量，很多国家制定了辣椒及其制品中红色素、黄色素限量标准。我国每年对外出口的辣椒干、辣椒粉及辣椒树脂，对方也均都在要求检验其中的辣椒红色素的含量〔1〕。本文从介绍了溶解性试验、显色反应、可见光谱测定方法〔1〕、分光光度测定法〔2,3]等对色素含量进行半定量分析以及薄层层析法检测辣椒红色素的方法。
1 鉴别试验
溶解度试验是指将辣椒红色素试样分别放入水、乙醇、甘油、植物油、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等溶剂中摇动，时间不少于30s(秒)，在5min内观察，并与溶解度的标准分级对照。色素应不溶于水和甘油，部分溶解于乙醇(油层分离)，易溶于植物油、乙醚、丙酮、乙酸乙酯〔1，4〕。显色反应是指在1滴色素中加2--3滴氯仿和1滴浓硫酸时，试样应呈现深蓝色〔4〕。辣椒红色素还可以通过分光光度法测定。该法包括测定紫外可见吸收光谱和红外吸收光谱〔5〕。紫外可见吸收光谱是取少量样品用石油醚溶解、稀释，以石油醚为参比，在分光光度计(岛津UV--260)上测定其吸收光谱。红外吸收光谱是将样品制片，在红外分光光度计(岛津IR--408)上测其IR光谱。将这两种测定结果与国标GB--10783--89比较，看其峰形与标准图谱是否吻合，是否具有标准辣红素的特征吸收峰，从而说明样品的纯度。
2 含量
(1)色价〔1，6] 用1．8M硫酸溶液配制每1份中含0．3005g重铬酸钾和34．96g硫酸铵钴晶体的溶液作标准比色液。在5cm见方的玻璃纸上称取50至80mg试样，精确至0．1mg。将纸和试样均置100mL容量瓶中，用丙酮定容后不时摇动，萃取15min以上。用10mi移液管吸取萃出液10.0mL，移入另一100mL容量瓶中，再用丙酮定容。用滤纸过滤，弃去10--15mL初滤液。将滤液滗入吸收池，用丙酮作为空白试样，测定460nm处的吸光度，同时测定标准比色液在460nm处的吸光度(As)，按下式计算：
可萃色素色值=丙酮萃出液在460nm处的吸光度x164xIf/试样量(g)
其中吸收池长度和仪器校准系数(If＝0．600／As)。
萃取液的As值应为0．30--0．70。如萃出液的As>0．70，则须用丙酮稀释至原浓度的一半。如萃出液的As<0．30，则须弃去，并用较大的试样量重新进行萃取。
(2)半定量测定样品中色素含量〔4〕取色素液，用丙酮适当稀释后在459nm处测光吸收值，按下式计算出样液中含原添加色素的g数。
样液中原添加色素的g数＝AKV／(原色素色价x100)
式中A为光吸收值，K为稀释倍数，V为样品色素提取液的总体积(mL)。
(3)薄层层析法分析辣椒红色素的成分〔4〕 溶剂萃取法提取的油状辣椒红色素由多种组分组成，极性大小不同，用展开剂系统可以将其分离。即将高效硅胶G板在110℃活化0．5h，将色素用丙酮稀释，用微量毛细管点样，点样后薄板放在层析缸中，按上行法展开，至斑点分开时终止层析，取出薄板晾干。计算展开系统薄层层析的Rf值。
3 质量指标分析
辣椒素含量〔1〕，残留溶剂，砷、铬，重金属测定分别按GT--26、OT--32、GT--16方法测定；灰分及干燥失重分别按GB5009．4--85、GB5009．3--85测定。
4 展望
随着食品工业的迅速发展，许多国家对食品添加剂的研究和应用也相应达到了先进的水平。人们对物质生活的要求不再满足于过去的温饱型，而要求营养、卫生、色形香味俱全。现代研究表明，合成色素大都有不同程度的毒性，危害人体健康，而天然色素则是人们必须的维生素来源。辣椒红色素作为一种天然色素，可广泛应用在食品工业中，但为了控制产品质量，许多国家对其进行限量，因此，辣椒红色素色价及其他指标的测定是必不可少的。文中所述为目前常用的辣椒红色素的检测方法。溶解性试验和显色反应反映该色素是否油溶性类胡卜色素，可见光谱则测定最大光吸收范围，薄层层析法测分析其基本组分。可见光谱法鉴别辣椒红色素需要和溶解性试验、显色反应、薄层层析法结合使用才能保证准确性，但是该种方法对辣椒红色素进行半定量测定的结果比较准确。用分光光度计法测定的辣椒红色素实际是胡萝卜色素的混合物，测定的色值称之为总色值，或粗色值〔7〕。针对这些方法中存在的不足，还需研究者的努力工作，在此基础上探索更简便、更快速、更准确的检测方法。
B. 从红辣椒中提取红色素实验点样时应注意什么
点样时，毛细管垂直轻轻点在原点标记上。毛细管在板上接触时间不宜过长，一般点样直径在2~3mm左右，若毛细管直径过粗，则样直径过大，影响色谱分离效果。
C. 实验室怎样从辣椒中提取辣红素
几种典型的辣椒色素提取精制方法
1.1 有机溶剂萃取法
根据辣椒色素的理化性质,工业上多采取以下方法进行提取:将茄科植物辣椒的成熟干燥果实之果皮粉碎后,用乙醇、丙酮、异丙醇或正己烷等抽提。考虑到天然红辣椒中含有辣椒红、辣椒素、辣椒油脂等成分,其中辣椒素即辣椒碱有辣味,高温下产生刺激性蒸气,因此在辣椒色素的精制过程中必须将其去除。从结构上看辣椒素含有酰胺键,分子中含有一个羟基,是一个极性化合物,其晶体呈现为单斜棱柱体或矩形,熔点61℃,溶于稀乙醇、己醚、丙酮、乙酸乙酯等溶剂及碱性水溶液中。考虑到辣椒红混合物和辣椒素在不同溶剂中溶解度不同,可以利用两者的溶解度差异进行脱辣处理。贺文智等[5]基于此原理采用正己烷萃取法,利用辣椒红色素易于溶于正己烷而辣椒素较难溶于正己烷的性质将两者进行分离,操作步骤如下:称取经去蒂、去籽、粉碎处理后的红辣椒粉末,以丙酮为萃取剂进行常压萃取操作,提取液在温度为90℃、真空度为0.09MPa的条件下进行减压蒸馏浓缩,同时回收丙酮。用丙酮提取辣椒红的过程实质上是液固之间通过相际接触表面进行的传质过程,传质速率的快慢决定着传质设备的尺寸及操作时间。该方法为了提高传质速率,采用索氏提取器对粉末状的干红辣椒进行提取。称取一定量的经浓缩的辣椒红粗产品用一定量的正己烷进行萃取脱辣,试验结果见表1。
色价定义为单位质量原料的提取物的吸光度。
该方法操作简单,色素回收率较大,产品得率高,但产品色价较小。由于色价值与辣度呈负相关性,说明该方法脱辣不够彻底,对于以辣椒红为主要产品且对辣椒素含量要求不是十分苛刻的情况,可以采用此方法。张宗恩等以丙酮为溶剂提取制备辣椒油树脂,油树脂得率高、色价大、辣素含量低,便于分离。采用pH值大于10.37的丙酮(50%)溶液进行5次以上脱辣萃取可得到口尝无辣味的红色素。该方法工艺简单、操作方便,所得色素的各项质量指标均符合FAO/WHO标准。
1.2 柱层析法据报道,辣椒中的辣椒素即使稀释1:100000仍能感觉到辣味,这在很大程度上限制了辣椒色素的应用。因此,去掉辣味成分就成为提取分离辣椒红色素工艺的关键步骤。用硅胶柱层析分离辣椒色素属分配层析法,是根据色素和辣素的结构差异,在束缚于硅胶上的固定相和洗脱液中的溶解度不同,因此在固定相和洗脱液之间的分配系数不同而达到分离效果。袁庆云研究了用硅胶柱层析分离辣椒红色素,总结出以下工艺流程:
辣椒→挑选→粉碎→加酶→过滤→浓缩→乙醇石油醚提取→过滤→浓缩→上硅胶柱→洗脱→浓缩→得深红色粘稠液体。
操作要领有:
1)加酶:加酶水解使细胞中与蛋白质、脂肪、糖类等结合的色素游离出来,便于用溶剂提取。
2)提取:以90%乙醇和石油醚(1∶1)的提取液在室温下搅拌过夜提取,经过滤后减压浓缩。3)通过薄层层析寻找洗脱条件,当石油醚和食用级90%乙醇体积比=2∶1时展层效果最好。
4)将提取的浓缩液上硅胶柱,柱直径10cm,高100cm,用洗脱液洗脱,收集红色洗脱部分
5)将收集的洗脱部分减压浓缩。
实验所得红色粘稠液经检验水分含量0.37%,脂肪含量90.68%,色素∶色阶E1%1cm(475nm)=143,不含辣椒素。贺文智、索全伶等[5]也探讨了辣椒红色素的柱层析提取精制方法:用丙酮作萃取剂从红辣椒干粉中提取出辣椒红粗品,粗品经减压蒸馏浓缩处理后进行柱层析脱辣精制操作。该试验鉴于柱层析法的优点,采用尺寸规格较大的玻璃柱进行柱层析分离,选用粒径74～152μm硅胶作填料,石油醚与丙酮的复配混合液(10:1)为展开剂进行柱层析。辣椒红粗品上柱淋洗分离,首先流出的是橙黄色液体(量少),其次是辣椒红色素,最后是较难洗脱的淡黄色且具有较浓辣味的液体。收集红色素产品进行减压蒸馏浓缩,用751分光光度计测定其色价E1%1cm(460nm)=56.5,色素回收率可达平均67.2%。
针对现有文献中大多介绍以红辣椒为原料提取无辣味混合色素的方法但未对混合色素作进一步分离分析的问题,提出了采用柱层析对辣椒色素中的黄色素进行分离。该方法以硅胶为固定相,丙酮、95%乙醇分别作为辣红素和辣黄素的洗脱剂,每次分离的色素量为硅胶质量的4%～2%,分离后的液体经减压蒸馏得浓缩产物。通过此过程,不但可得到辣椒色素中的主要副产品———黄色素,而且相应地提高了主要成分的纯度,得到纯度较高的红色素。
采用柱层析分离技术,选用吸附剂X和混合洗脱液用于中试,将辣椒色素中红、橙、黄进一步分离,可以使低质量辣椒红色素的色价和色调得到较大的提高。吴明光等采用柱层析分离技术,从辣椒果皮中分离出了游离型结晶辣椒红色素单体,其含量大于95%,这是我国辣椒红色素在剂型上的突破。
1.3 超临界CO2流体萃取技术
由于辣椒红素的油状特性使得采用有机溶剂萃取分离得到的辣椒色素产品中有较高的溶剂残留,采取一般的洗脱剂方法产品很难达到联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO,1984)规定的最新标准,极大地影响了辣椒色素的实用和出口创汇。超临界流体萃取是一种新型的化工分离技术。该技术的关键是了解超临界流体的溶解能力及随诸多因素影响的变化规律。超临界CO2流体萃取(SCFE-CO2)就是使用高于临界温度、临界压力的CO2流体作为溶媒的萃取过程。处于临界点附近的流体不仅对物质具有极高的溶解能力,而且物质的溶解度会随体系的压力或温度的变化而变化,从而通过调节体系的压力或温度就可以方便地进行选择性地萃取分离不同物质。超临界分离技术工艺简单,能耗低,萃取溶剂无毒、易回收,所得产品具有极高的纯度,残留溶剂符合FAO/WHO要求。赵亚平等采用自行设计的超临界CO2流体萃取设备进行辣椒色素提取。该设备主要由供气系统、超临界CO2流体发生系统、萃取分离系统、计量系统4部分组成,所有部件都国产化。实验表明,最佳萃取条件为粒度<1.2mm,萃取压力15MPa,萃取温度50℃,流量6m3/h。在萃取过程中,根据UV3000紫外可见分光光度计测定200～600nm的吸光度曲线判断辣椒色素与辣椒素的分离效果。用色素的丙酮溶液在449nm处测定吸光度,所得值即为色素的色价。从表2可以看出,用该方法萃取的辣椒色素各项质量指标均超过国家标准。
采用瑞士NOVA公司制造的超临界萃取装置对辣椒色素进行分离、提纯。使产品符合FAO/WHO残留溶剂标准要求(己烷含量≤25mg/kg)的最佳工艺参数是:萃取压力18MPa,萃取温度25℃,萃取剂流量2.0L/min,萃取时间3h。在最佳工艺条件下产品色价可达到342。韩玉谦等采用超临界CO2流体萃取技术对色价100～180,溶剂残留30×10-6～150×10-6的辣椒红色素进行精制,实验结果表明:当萃取压力控制在20MPa以下时,辣椒红色素的色价和色调几乎不受损失,有机溶剂的残留可以降低到2.7×10-6左右,但辣椒色素中的红色系色素和黄色系色素未达到完全分离。研究发现,在超临界CO2流体萃取辣椒色素的过程中使用助溶剂如1%的乙醇或丙酮或升高提取压力能提高辣椒色素得率。在较低压力下分离得到的辣椒色素几乎都是β-胡萝卜素,而在较高压力下得到较大比例的红色类胡萝卜素如辣椒红色素、辣椒玉红素、玉米黄质、β-隐黄质等和少量的β-胡萝卜素。在两步分段提取过程中,第一阶段采用分离红辣椒油和β-胡萝卜素的技术保证了第二阶段辣椒色素提取的富集,并使辣椒红、黄色素比率达到1.8。在自行开发的多功能超临界CO2流体萃取分馏装置上对辣椒色素脱辣精制技术进行了研究,结果表明:在小于10.0MPa压力下可萃取出黄色和辣味成分,保留红色素;当压力大于12.0MPa时可将红色组分萃取完全。尽管超临界流体萃取天然色素具有很多的优点,但由于超临界设备一次性投资较大,目前我国在这一领域还未得到广泛的应用。
1.4 其它
采用两步法萃取分离红辣椒,即先用有机溶剂浸取法从干尖辣椒中萃取出含有红色素、辣椒素和焦油味臭味的辣椒浸膏,然后再用超临界CO2萃取的方法去除焦油味臭味并把红色素和辣椒素分开,从而得到不含有机溶剂的红色素和辣椒素,产量较单纯用超临界萃取方法提高5～7倍,且质量远超过FAO/WHO(1984)标准。姚祖凤、姜洪杰等以6种分离、提取方法进行了54次实验,通过这些实验了解到:辣椒红色素的得率和质量与生产技术和工艺条件有着密切的关系。通过对比分析,可以比较这6种生产技术的先进性和实用性。6种工艺的基本情况见表3。
D. 辣椒红色素的提取方法有哪些各有什么优缺点
1、 油溶法
油溶法是在常温下用呈液状的食用油( 如棉籽
油、豆油、菜籽油等) 浸渍辣椒果皮或干辣椒粉, 使
辣椒红色素溶解在食用油中, 然后通过一定的方法
从油中提取出辣椒红素的一种方法[8]。
工艺流程: 辣椒→浸提→蒸馏→辣椒油树脂→
水解→ 过滤→ 固型物→ 浸泡→ 减压过滤→ 提取
液→减压蒸馏→浓缩精制色素→烘干→粉末状辣
椒色素。
用油溶法提取辣椒红色素时, 油与色素的分离
较困难,使得辣椒红色素物质提取率低,难以得到色
价高的产品,现已基本停止使用。
2、溶剂法
这是辣椒红色素的常规生产方法: 将去除坏
椒、梗、籽的干辣椒磨成粉后, 用有机溶剂( 如丙酮、
乙醚、氯仿、三氯乙烷、正己烷等) 进行浸提, 将浸提
液浓缩得到初辣椒油树脂, 减压蒸馏得产品[9]。
工艺流程: 辣椒粉末→有机溶剂提取→减压回
收溶剂→油状红色素→有机溶剂萃取→减压回收
溶剂→产品
采用有机溶剂提取辣椒红素有四种方法: 浸渍
法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法。
目前国内外生产辣椒红色素的厂家绝大多数
都采用溶剂法提取, 但以上各种提取方法无论采用
那种生产,在提取前均需将辣椒粉碾成粉末,操作费
用较高。此外, 由于提取后的残渣中还残留有相当
量的红色素[10], 所得出品的杂质含量高,精制费用昂
贵,残渣的可利用性差,给生产带来困难。伍明等谈
到在天然辣椒红色素的提取新工艺时, 提到采用热
逆流法提取辣椒红色素的新工艺[11]。
工艺流程:辣椒干→去籽切碎→提取辣味素→除
辣→提取红色素→减压浓缩→真空干燥→红色素
↓
残渣深加工→副产品
其优点主要表现在三个方面: 1) 提取时间短,
溶剂用量少, 收率高, 色价高; 2) 原料在提取前不需
要粉碎成粉末, 操作费用降低, 残渣的利用价值大。
目前已开发出附加值高的系列产品。另外, 避免了
由于过分破坏植物细胞壁, 而造成一些分子量较大
的组分被浸取出来的缺点[12]。本工艺集过滤、提取、
浓缩与一体, 因而设备投资和操作费用相对较低;
3) 利用本工艺提取红色素可以一次得到成品, 产品
无须精制, 各项指标均符合有关标准。
总之, 本工艺具有较高的应用价值, 由于所用
设备与目前通用的溶剂法提取辣椒红色素的设备
接近, 故也为生产厂家的工艺改造提供了一种理想
的途径。
3、 超临界CO2 流体萃取法
超临界CO2 流体萃取就是使用高于临界温度、
临界压力的CO2 流体作为溶媒的萃取过程。超临界
流体萃取是一种新型的化工分离技术, 关键是了解
超临界流体的溶解能力及随诸多因素影响的变化
规律。此技术工艺简单, 能耗低, 萃取溶剂无毒、易
回收, 所得产品具有极高的纯度, 残留溶剂符合FA
O/WHO 要求。
萃取法制得的色素多为混合色素,方法简便,成
本相对较低, 色价高, 已成为国内外通用的制备工
艺。本法是一种先进的提取方法, 但还有待于进一
步完善。
4、 硅胶柱层析法
硅胶柱层析分离辣椒色素属分配层析法, 是根
据色素和辣素的结构差异在束缚与硅胶上的固定
相和洗脱液中的溶解度不同, 因此在固定相和洗脱
液之间的分配系数不同而达到分离效果。这个操作
简单, 设备条件要求不高, 分离效果很好, 去除辣味
完全。此柱洗脱液为石油醚: 乙醇( 90%) =2∶1 混合溶
剂。
内蒙古工业大学提取红色素时, 其柱层析法采
用100 ～200 目硅胶为填料, 石油醚与丙酮( 体积比
为10∶1) , 复合液为洗脱液; 色素回收率为67.2%, 而
且色价较高为65; 可以形成橙黄、红色与淡黄色三
条带, 有利于红辣椒中有效成分的精细分离。
袁庆云用硅胶柱层析分离辣椒红色素[13], 方法
为: 成熟的干辣椒经酶处理后用乙醇和石油醚混合
溶剂提取。提取物通过硅胶柱层析分离, 得到无辣
味的红色素, 再经真空浓缩成粘稠状。得到的红色
粘稠液, 经贵州省药品检验水分含量0.37%, 脂肪含
量90.68%, 色素: 色价为143, 不含辣素。
层析法虽然可制得多种色价的产品, 如呈紫红
色的辣椒红色素和呈橙红色的辣椒玉红素分开, 但
操作费用高, 工艺复杂且难度大。
5、薄层色谱
薄层色谱法分离迅速, 效率高, 灵敏度高, 而且
可用于制备和定量分析, 许多天然色素都可用薄层
色谱进行分析。陈连之等人[14]用20320 硅胶( 上海海
洋化工研究所) 自制板, 在石油醚∶丙酮=10∶1 的展开
剂中, 上行15 分钟得TLC 色谱图。主要黄色素成分
集中在黄1～黄3, 主要红色素成分集中在红1～红
3, 并得Rf( 黄1) 为0.86, Rf( 红1) 为0.46。
6、 溶剂微波提取法
微波是电磁波的一种, 其波长从1mm～lm, 因其
波长介于短波和远红外之间, 故称微波。作为一种
高频电磁波, 微波对处于微波场下的物质发生作
用, 物质中的分子在电场作用下可被电离而极化,
形成极化分子, 极化分子具有正负二极, 它们在电
场中产生定向排列。物料内的极化分子随着微波电
磁场的交替变化, 发生高频振荡。分子运动产生热
量, 这就是微波炉加热的原理。将微波应用于提取,
其对物质的作用表现在: 当被提取物和溶媒共同处
于微波场下时, 目标组份分子受到高频电磁波的作
用, 产生剧烈振荡, 分子本身获得了巨大的能量( 即
活化能) 以挣脱周边环境的束缚, 当环境存在一定
浓度差时, 可以在非常短的时间内实现分子自内向
外的迁移达到一个平衡点。这就是微波可以在短时
间内实现提取目的的原因。
微波提取技术应用于中药有效成分的提取, 可
以克服传统提取方法本身固有的种种缺陷, 表现出
良好的发展前景和巨大的应用潜力。与传统提取方
法相比, 微波提取可以缩短生产时间, 降低能源溶
剂的消耗, 同时可以提高收率和提取物纯度。它的
优越性不仅在于降低设备投资和运行费用, 而且也
符合环境保护的要求。
7、超声波溶剂提取法
此方法在提取过程中, 通过产生强烈的振动,
空化, 搅拌, 从辣椒粉中提取出辣椒红色素。与传统
的提取方法比较, 此法具有收率高, 生产周期短, 无
需加热, 有效成分不破坏等优点。
8、 酶法提取
周旭章等研究提出醇提辣一酶脱脂二步法精
制辣椒红色素粗制品的新工艺。脱辣最佳工艺条
件: 温度为室温; 脱辣剂( 乙醇) 浓度70% ; 投料比1:
2.5 ～1: 3; 萃取次数3 ～4 次。脱脂最佳工艺条件为
pH 8 室温, 脱脂剂(Mix 酶) 浓度10 ～15 mg/L, 反应
时间50min。邵学军等研究不同浓度NaOH 溶液浸
泡辣椒粉脱辣效果, 试验结果认为, 用NaOH 溶液攫
泡辣椒粉脱除辣素的最佳操作条件为辣椒粉( g) 与
15%NaOH 溶液(m1) 之比为1:9, 90℃浸泡1.5 h。