层析实验装置图

㈠ 仪器分析——层析技术二、层析法实验技术

（一）凝胶层析法

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化斗旦晌性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。

⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的空锋层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。

⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。

凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。

⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。

⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

如果不迟碰再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

⒍凝胶层析的应用

⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

（二）离子交换层析法

离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：

C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1

式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。

洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。

⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

㈡ 是谁制造出第一台色谱仪

色谱法,又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。它的英文名称为：chromatography这个词来源于希腊字 chroma和 graphein，直译成英文时为 color和writing两个字;直译成中文为色谱法。但也有人意译为色层法或层析法。

右图为高中生物学实验中的叶绿体色素纸层析分离实验，就是一种简单常见的色谱分析方法（纸色谱）。

1906年由 Tswett 研究植物色素分离，提出色谱法概念；他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。
在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationary phase） ；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相（mobile phase）。

柱色谱（Column chromatography)为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。

纸色谱 (Paper chromatography)以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。 （图片就是纸色谱法。）

薄层色谱(Thin-layer chromatography)是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分离。常用于探索柱色谱实验条件，溶剂和固定相的选择等。

常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流动相为水、苯等各种有机溶剂。

色谱法的分类方法很多，最粗的分类是根据流动相的状态将色谱法分成四大类。

色谱法按流动相种类的分类：
┌————————┬———————┬———————————————┐
│ 色谱类型 │ 流动相 │ 主要分析对象 │
├————————┼———————┼———————————————┤
│气相色谱法 │ 气体 │ 挥发性有机物 │
│液相色谱法 │ 液体 │可以溶于水或有机溶剂的各种物质│
│超临界流体色谱法│ 超临界流体 │ 各种有机化合物 │
│电色谱法 │缓冲溶液、电场│ 离子和各种有机化合物 │
└————————┴———————┴———————————————┘

色谱仪chromatograph

为进行色谱分离分析用的装置。包括进样系统、检测系统、记录和数据处理系统、温控系统以及流动相控制系统等。现代的色谱仪具有稳定性、灵敏性、多用性和自动化程度高等特点。有气相色谱仪、液相色谱仪和凝胶色谱仪等。这些色谱仪广泛地用于化学产品，高分子材料的某种含量的分析，凝胶色谱还可以测定高分子材料的分子量及其分布。

例：

MC029-GC102气相色谱仪
该产品为实验室用的填充相气相色谱仪，具有热道、氢焰二种检测器，定温控制恒温槽及气流控制装置。可广泛应用于石油、化工、医学及厂矿科研单位作为生产控制、科学研究方面的有机、无机气体和沸点400℃以内的液体样品进行常量、微量分析。
特点：
□石油炼制工业及其特种油类的制造过程的控制和质量检验。
□人造纤维及合成树脂等对其原料体、中间体聚合过程中的控制或质量检验。
□农业的化肥、农药的分析及合成过程中原料体、中间体的控制或质量检验。
□医药卫生方面的制药、劳动防护、有毒气体的分析分离等。
□生物化学方面的生物液体分离分析研究等。
技术指标：
□检测器灵敏度：热导池：S≥1000mVml/mg；载气H样品C6H6；氢焰：Mt≤1?0－10g/sec；载气N2样品C6H6
□检测器稳定性：基线漂移：≤0.05mV/h
□层析柱恒温室：（室温＋40℃－300℃）；恒温精度：?.3℃；有效区最大温差：2℃； 气化室：最高400℃

㈢ 如图是纸层析分离叶绿体中色素的装置图，层析后得到不同的色素带，在暗室内用红光照射四条色素带，可以看

图中滤纸条上的四条色素带①②③④分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b．在暗室内用红光照射四条色素带，由于叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，所以叶绿素a和叶绿素b色素带较暗．
故选：C．

㈣ 怎样画好层析图

1．用毛细吸管画线可使细线尽量细，沿着铅笔线画是要保证滤液细线直，从而使分离出来的色素带整齐。
2．滤纸上的滤液细线如果触到悔告哪层析液,滤纸上叶碧码绿体中的色素就会溶解到层析液中,实验就会失败，所以滤纸上的滤液细线不能触到层析液
3.提取叶绿体中色素的关键主要是:一、叶片要新鲜、浓绿；二、研厂处班肺直镀绊僧豹吉磨要迅速、充分；三、滤液收集后,要及时用棉塞将试管口塞紧,以免滤液挥发。
分离叶绿体中色素的关键主要是:一、滤液细线不仅细、直,而且含有比较多的色素(可以画二三次)；二、滤纸上的滤液细线不能触到友滑层析液。

㈤ 离子交换层析的具体操作

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。 已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建议用0.02%叠氮钠。

㈥ 对硝基乙酰苯胺温度升高,哪一个产物占比会提高

本实验用乙酰苯胺作为起始原料，首先经过硝化获得了邻硝基乙酰苯胺和对硝基乙酰苯胺的混合物。接着采取了两种分离纯化的途径：一种是先将制得的混合物经过重结晶后获得纯的对硝基乙酰苯胺，通过测定固体的熔点来验证所得对硝基乙酰苯胺的纯度。再将重结晶后的产品用氢氧化钠的醇溶液水解，取水解后的产品作薄层析和熔点测定来确定水解后的产物。另一种方法是直接将硝化后的混合物水解，制得邻硝基苯胺和对硝基苯胺的混合物。通过薄层分析和熔点的测定来证实两者的存在。再分别用重结晶和水蒸气蒸馏的办法分离纯化所获得的产品。并通过薄层析和测熔点的方法来验证产品的组成和纯度。最后，根据实验结果分析比较两种分离纯化途径的优劣。绪言：对硝基苯胺常温下是淡黄色针状结晶，易于升华。熔点 148.5℃，沸点 331.7℃，相对密度1.424（20/4℃）。闪点199°，水中溶解度为0.0008g。微溶于冷水，溶于沸水、乙醇、乙醚、苯和酸溶液，有毒，空气中容许浓度为5mg/m3。吸入、口服和皮肤接触有害。所以在实验过程中要尽量避免与之接触。对硝基苯胺是染料工业极为重要的中间体，可直接用于合成：对苯二胺，邻氯对硝基苯胺， 2.6-二氯-4硝基苯胺，5-硝基-2-氯苯酚等，同时还是防老剂，光稳定剂，显影剂等的原料。可作黑色盐 K，供棉麻织物染色、印花之用。并且可作农药和兽药的中间体，在医药工业中可用于生产氯硝胺、卡巴肿、硝基安定、喹啉脲硫酸盐等。还可用于生产对苯二胺；抗氧化剂和防腐剂等。因此对硝基苯胺的合成具有很大的应用价值。工业上生产对硝基苯胺的方法有乙酰苯胺的硝化水解和对硝基氯苯氨解两种方法。本实验采用的是乙酰苯胺硝化水解的方法，具体步骤将在实验部分给出。反应原理如下：1、乙酰苯胺的硝化
2、硝基乙酰苯胺的水解：而纯化和分离的办法主要采取了薄层析、重结晶、水蒸气蒸馏三种办法。三者的分离原理如下。薄层析：薄层色谱（TLC）是用来鉴别产物成分与辨别产物纯度的有效方法。不同物质的极性不同因此与展开剂的作用力不同，当物质随展开剂攀援而上时会由于攀援速度不同而分离开来。
溶剂前沿与起始线间距离品点与起始线距离
溶剂前沿
样样品点与起始线间距离品点与起始线距离
起始线
重结晶：重结晶是纯化静态物质的普适的、最常用的方法之一。用适当的溶剂把含有杂质的晶体溶解，配成接近沸腾的浓溶液，趁热滤去不溶性杂质，使滤液冷却析出结晶，以达到纯化晶体的目的。水蒸气蒸馏：有机物与水一起共热，当体系总的蒸气压等于大气压力时，体系沸腾，此时，有机物在低于100 oC的温度下随蒸气一起蒸出来，这样的操作叫做水蒸气蒸馏。♦ 水蒸气蒸馏的用途及适用场合：水蒸气蒸馏是用来分离和提纯液态或固态有机化合物的一种方法，常用于下列场合：（1）某些沸点高的有机化合物，在常压蒸馏虽可与副产品分离，但易将其破坏。（2）混合物中含有大量树枝状杂质或不挥发性杂质，采用蒸馏、萃取等方法都难于分离；（3）从较多固体反应物中分离出被吸附的液体。♦ 被提纯物质必须具备以下几个条件：（1）不溶或难溶于水；（2）共沸腾下与水不发生化学反应；（3）在100 oC左右时，必须具有一定的蒸气压[至少666.5 ~ 1333 Pa(5 ~ 10 mmHg)]实验参数表格：
名称 分子量 性状 折光率 比重 熔点（oC） 沸点（oC） 溶解度（/100g）
水 醇 醚
乙酰苯胺 135.17 白色有光泽片状结晶 1.5860 1.219 114.3 304 0.46（20oC） 36.9（20oC） 溶
临硝基乙酰苯胺 180.16 淡黄色片状或棱状晶体 1.4149 94 100（0.133 KPa) 溶于沸水微溶于冷水 溶于乙醇 溶于乙醚
对硝基乙酰苯胺 180.16 无色晶体 1.41 215.6 100（1.06x10-3KPa） 溶于热水 溶 溶
邻硝基苯胺 138.13 橙黄色针状晶体 1.44 69.7 284.5 微溶于冷水溶于沸水 溶于乙醇 易溶于乙醚
对硝基苯胺 138.13 淡黄色针状晶体，易升华 1.424 148.5 331.7 0.0008g（冷水）溶于沸水 溶 溶
实验内容：
实验流程图
邻、对硝基苯胺
对硝基乙酰苯胺
测熔点 测熔点 薄层析
重结晶
水蒸汽蒸馏
水解

对硝基苯胺
对硝基苯胺
邻硝基苯胺
测熔点 薄层析
薄层析
测熔点
薄层析
测熔点
对硝基苯胺
实验步骤1、乙酰苯胺的硝化：在100 mL三口烧瓶中放入5.00g制得的乙酰苯胺，加入10.0mL冰醋酸。安装上电磁搅拌装置。在三颈瓶口分别装上温度计、回流冷凝管、恒压滴液漏斗。在恒压漏斗中加入4.0 mL浓硝酸（比重为1.14 g/mL， 0.03 mol）和8 .0mL浓硫酸（比重为1.84 g/mL）配成混酸。三颈瓶外用电热煲控温在50±5 oC，边搅拌边缓慢加入混酸（约需20 min），加完后60 oC左右继续反应1小时。然后将反应液倒入20 g碎冰中，即有黄色沉淀析出，过滤、水洗至中性。
实验装置图（一）硝化装置2、硝基乙酰苯胺的水解：将得到的固体均分为两份，一份进行重结晶，粗产品转移到50ml烧瓶中，加入约10mL乙醇，在搅拌下加热至沸腾。观察有未溶解的固体，再补加乙醇约8mL后固体全部溶解，最后补加了5mL乙醇。稍冷后，加入0.5g活性炭，并煮沸10min。在保温漏斗中趁热过滤除去活性炭。滤液倒入热的烧杯中。然后自然冷却至室温，冰水冷却，待结晶完全析出后，进行抽滤。用少量冷水洗涤滤饼两次，压紧抽干。将结晶转移至表面皿中，烘干后测定重结晶后固体的熔点，再将重结晶后的固体用自配的氢氧化钠醇溶液在加热沸腾的情况下回流水解半小时，再加入3.0mL水加热沸腾的情况下回流水解20min。再将溶液稍冷后倒入20 g冰水中，过滤，用水洗至弱碱性，烘干得水解产物。取水解后的产物做薄层分析和熔点测定。水解装置 + 重结晶装置 实验装置（二）2.2 取另一份直接水解，水解方法与2.1中一样，水解之后仍将固体均分为两分，一份进行重结晶，重结晶的方法与2.1类似，只是乙醇的用量减半。再将重结晶的样品烘干测定熔点，并做薄层分析。将另一半固体进行水蒸气蒸馏，将蒸馏后收集到的馏分每次用10mL氯仿分两次萃取。将萃取所得液体再次蒸馏，直至烧瓶内溶剂仅剩3mL自然冷却至室温，将所得样品进行薄层分析。蒸馏装置 萃取装置实验装置（三)实验结果与讨论：1.实验结果：1.1熔点测定结果
物质 T初（oC） T全（oC） 熔距ΔT（oC） 标准熔点T（oC）
对硝基乙酰苯胺（初产品重结晶） 165.0 193.0 28.0
168.0 190.0 22.0 215.6
对硝基苯胺（重结晶加水解） 144.0 149.0 5.0
143.0 152.0 9.0 148.5
直接水解的初产品 60.0 63.0 3.0
61.0 63.0 2.0 69.7
水解+重结晶后的产品 59.0 65.0 6.0
61.0 66.0 5.0 69.7
对硝基苯胺（水解+水蒸气蒸馏） 145.0 149.0 4.0 148.5
146.0 150.0 4.0
1.2薄层析结果：
物质 Rf值 样点黄色深浅 样点性状
重结晶再水解产品 样点1 0.59 颜色很浅， 椭球状
纯邻硝基苯胺 0.63 颜色深 椭球状
样点2 0.28 颜色极深 长条楔形
纯对硝基苯胺 0.28 颜色深 椭球状
直接水解的初产品 样点1 0.59 颜色深 椭球状
纯邻硝基苯胺 0.61 颜色深 椭球状
样点2 0.28 颜色浅 椭球状
纯对硝基苯胺 0.28 颜色深 椭球状
水解+重结晶后的产品 样点1 0.56 颜色深 椭球状
纯邻硝基苯胺 0.56 颜色深 椭球状
样点2 0.28 颜色很浅 椭球状
纯对硝基苯胺 0.28 颜色深 椭球状
对硝基苯胺（水解+水蒸气蒸馏） 样点1 无 无 无
纯邻硝基苯胺 0.61 颜色深 椭球状
样点2 0.27 颜色深 椭球状
纯对硝基苯胺 0.27 颜色深 椭球状
邻硝基苯胺（水解+水蒸气蒸馏） 样点1 0.54 颜色深 椭球状
纯邻硝基苯胺 0.54 颜色深 椭球状
样点2 无 无 无
纯对硝基苯胺 0.26 颜色深 椭球状
2、实验讨论（1）熔点测定分析由硝化产物直接重结晶得到的对硝基乙酰苯胺的熔点测定结果来看，熔程长，熔点相较于标准的对硝基乙酰苯胺的熔点-215.6oC来说偏低了许多。造成该实验结果的主要原因有：① 从得到的产品的晶型来看，产品呈土黄色泥状，基本看不出晶态。而晶体的晶型对晶体的熔点有很大的影响，我所得到的产品更偏向于是多晶或非晶，所以熔程较长。② 熔点低说明所含的杂质多，重结晶的效果欠佳，包含的杂质初步判断为临硝基乙酰苯胺。判断的理由是硝化过程中，在酸的作用下会有少量的乙酰苯胺被水解生成苯胺，但由于量少，在重结晶的过程中会全部溶解于溶剂中，不会给实验结果带来很大影响，而含量较多的邻硝基乙酰苯胺则会因为重结晶的的效果不佳而使得实验结果偏低。③ 熔点仪的温度计测温不准，造成所得数值偏低，这在其他的几个熔点测定实验中也可以看出。④ 晶体不够干燥。①、② 两个解释最本质的原因是重结晶的过程中所加的溶剂量不够，溶剂用量不足会使得邻硝基乙酰苯胺在低温时并不能完全溶解在溶剂中，而随着对硝基乙酰苯胺一起析出，再加上晶体析出过程中，由于溶剂量过少，溶质析出过快，成核密度太大，微粒不能形成晶体而是以沉淀形式存在，且相对表面积增大，吸附现象严重，总的结果就是熔程长、熔点偏低。
（2）薄层析结果分析①从薄层析结果来看，邻硝基苯胺的样点随溶剂移动的速度更快，比移值更大，是由于邻硝基苯胺的极性比对硝基苯胺小，因此与吸附剂的结合力更弱，在吸附与脱吸的交替过程中脱吸占上风，因此与溶剂一起攀爬的速度快于对硝基苯胺。②薄层析中，硝化后重结晶再水解的样品的样点拉得很长，并不是清晰的一点，说明产品纯度不高。除了有邻硝基苯胺和对硝基苯胺外还有其他有色杂质，这可能是硝化过程中由于温度控制不当，有多硝基化合物生成。多硝基化合物的生成会使得产品颜色加深，而我所得到的产品颜色确实很深。由此观之确实有少量多硝基化合物存在。（3)综合分析1、为什么要用氢氧化钠醇溶液作为水解试剂：胺基具有给电子性会使酰基碳钝化，因此水解所需的条件要剧烈一些，氢氧化钠醇溶液碱性强，水解效果好，以乙醇作溶剂提供了一个均相体系使反应更容易发生。2、水解产品分析重结晶后水解的产品中对硝基苯胺占绝大部分，但仍有少量的邻硝基苯胺，这从薄层析和熔点测定的结果中都可以看出。薄层析结果显示样品存在两个样点，一个与纯的邻硝基苯胺样点移动的速度一致，但颜色很浅；一个与纯的对硝基苯胺样点移动的速度一致，但颜色深。熔点测定时，熔点与对硝基苯胺的熔点十分接近。这两个实验结果都表明产物主要是对硝基苯胺。造成最终的产品中仍有邻硝基苯胺的原因很大一部分在于重结晶时的效果不好，有邻硝基乙酰苯胺，所以在水解之后产品不纯。直接水解后的样品熔程短，熔点为62oC，十分接近邻硝基苯胺的熔点，而薄层色谱中样品仍有两个样点，一个与纯的邻硝基苯胺样点移动的速度一致，颜色很深；一个与纯的对硝基苯胺样点移动的速度一致，但颜色很浅。由熔点测定结果和薄层色谱结果可以得出，直接水解的产物中邻硝基苯胺居多。将初产品重结晶后，测得的熔点为63oC，相比于未重结晶的产品更接近纯的邻硝基乙酰苯胺的熔点，但改善不大。除了熔点改善不大之外，薄层色谱也十分相近。另外还有明显的熔程变长。而理论上重结晶后应该会使得熔程变短，熔点更接近真实值，所以实验结果与理论之间出现了悖论。这其中的原因是我在直接水解之后，将水解后的产品

㈦ 纸层析法可分离光合色素，下列分离装置示意图中正确的是（）A．B．C．D

A、层析液是由2份丙酮和1份苯混合而成，具有一定的毒性，因此用橡皮塞赛紧瓶口内，A错误；
B、层容析液容易挥发，需要用橡皮塞赛紧瓶口，另外滤液细线触到层析液，则色素溶解在层析液中，滤纸条上得不到色素带，B错误；
C、有滤液细线的一端朝下，并没有触到层析液，则滤纸条上分离出四条色素带，C正确；
D、滤液细线触到层析液，则色素溶解在层析液中，实验失败，D错误．
故选：C．

㈧ 绿叶中色素的提取与分离实验的四步改进|色素带

“绿叶中色素的提取与分离”实验的目的是通过实验操作，使学生对绿叶中色素的种类及含量有直观感性的认识。 根据以往经验，学生实验失败的原因有：研磨不充分，画线粗而不均匀，层析时滤纸条贴壁或误加其他试剂污染了层析液。现针对研磨、画线、层析等步骤，对此实验作出四点探究与改进。下面所用材料皆为白菜叶，层析液皆采用石油醚、丙酮、苯(20：2：1)配方。

1研磨方法的改进――两步研磨法

1.1操作步骤
采用课本的方法将试剂全部加入再研磨，会使研钵内液体较多，不易着力，容易导致研磨不充分。过滤得出的滤液呈淡绿色，使分离的色素带颜色过浅。
研磨时加入二氧化硅有助于研磨充分，加入碳酸钙可防止研磨中色素被破坏，加入无水乙醇为了溶解与提取色素。针对三种试剂的作用，可减少用量，分次加入，两步研磨，以更好地提取叶绿素。具体步骤如下：
(1)称取3g绿叶，剪碎，放入研钵。
(2)加入少量二氧化硅及碳酸钙，研磨至初步呈糊状。
(3)加入5mL无水乙醇。
(4)研磨至均匀后，静置2min。
(5)过滤。

1.2结果讨论
分两步研磨，第一步有利于研磨充分，省时省力。待绿叶初步呈糊状再加入无水乙醇继续研磨，并适当静置，有利于叶绿素充分溶解到乙醇中，得出的滤液呈墨绿色，保证下一步色素分离的效果。

2画线方法的改进――毛笔画线法

2.1操作步骤
(1)距滤纸条尖角端1cm用铅笔画一横线。
(2)用未泡开的新毛笔尖端沾取少量滤液，沿铅笔线均匀画出一条滤液线。
(3)待滤液线干后，重复3-5次。

2.2结果分析
(1)毛笔画线法所需用具简易。毛笔易购买，可重复使用，且笔杆长，沾取滤液非常方便。
(2)毛笔画线与学生书写习惯相近，更容易画出平直的细线。而且滤液细线容易晾干，相同的时间内可反复画更多次，弥补每次画线所吸收的色素量较少的不足，保证滤液线含有足够的色素。
(3)毛笔轻柔，多次描画也不会划损滤纸，利于层析分离。
(4)用毛笔画线，滤纸条吸收叶绿素更加均匀集中，色素分离更快，也更平整。有利于在更短的时间内，正确认识绿叶色素的种类和含量，尤其能很好地体现课本所给出的各种色素含量的比例关系(图1)。


3滤纸条形状对好兄实验效果的影响

3.1操作方法
课本要求将滤纸条的一端剪去两角，以减少滤纸边缘的浸润现象，让色素带跑得更平直。现用七种形状的滤纸条作对比，探究何种形状的滤纸条利于色素带的平直。画线方法均采用毛笔画线法。

3.2实验结果(图2、图3)



3.3结果讨论
从七种形状的滤纸条的层析效果图可见，一端较尖长的滤纸条(3、4、5号)能更好地减低边缘浸润作用。同时，长梯形端能起到提示学生画线部位的作用。作为毛笔画线法的重复实验也可见，毛笔画线法所得出的色素带都很平直均匀。

4层析装置的改进――简易层析瓶

教科书采用试管作为层析的装置。虽然试管口小，可减少层析液的挥发，但试管空间窄而深，容易造成滤纸条贴壁，致使实验失败。现将装置改为简易层析瓶，制作方法如下：
(1)取100mL烧杯。
(2)取一圆形滤纸，用小刀在滤纸上刻出间隔合理的多个缺口，用于插入和固定滤纸条。
(3)用透明胶将制作好的滤纸固定在烧杯口上，作为简易盖子。
(4)插入滤纸条。
此装置(图4)可同时放置多条滤纸条，而且位置固定，可避免滤友友袭纸条贴壁或相互交叠。简易盖子可减少层析液挥发，同时能避免学生因错误操作而倒入滤液，污染层析液，致使实验失败。此装置制作简便，可重复使用，能满足示范性告没高中上千学生做实验的需要，实验员每节课后统一回收和加液也比较方便(可使用针筒或掀开盖子)。

5实验结论

经实践证明，采用了两步研磨法、长梯形滤纸条、毛笔画线法及新式层析装置四步改进之后，学生实验的成功率大大提高，接近95％。而且所显示的色素带比较平整，能很好地体现色素种类与含量，尤其是体现教科书所给出的各色素含量之间的比例关系。操作上由于减少了量取层析液等步骤，更省时省力，有利于教学时间的安排。

㈨ 细胞的能量供应和利用

本实验的地位和作用

光合作用是高中生物学习的重点和难点内容。叶绿体是光合作用的场所，做好叶绿体中色素的提取和分离实验，有助于学生理解光合作用色素的种类和作用、加强学李散生对光合作用的理解和掌握。

创新动机

在提取叶绿体中色素时要用到丙酮，进行色素分离时要用层析液。丙酮和层析液有很强的挥发性，学生在进行实验的过程中难免会吸入一定的挥发性物质，对身体健康产生影响。所以，本实验要求在通风的条件下进行，实验结束后一定要用肥皂将手洗净。因此，许多教师希望能通过改进实验，降低有毒物质的挥发，保护学生的身体健康。

新教材实验存在的问题及分析

1、新教材中实验的原文是：“将3 ml层析液倒入试管中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）轻轻插入层析液中，随后用棉塞塞紧试管口。注意不能让滤液细线触敬粗及层析液。”

2、假如我们按照新教材中的实验要求操作，将 3 ml层析液倒入不同型号大小的试管中，就会看到下面的现象，层析液的高度都会超过1 cm，滤液细线会触及层析液而导致实验失败。

3、建议教材做如下改进：“将适量的层析液倒入试管中”。

改进一：自制密闭式色素分离器

实验装置如下图所示

操作步骤：

1、实验前教师用注射器预先吸取适量的层析液。

2、色素分离时将底座倒入适量的水。

3、将画好滤液线的滤纸条用夹子夹好，罩上罩子。

4、用注射器缓缓推入预先吸取的层析液。注意：不能让层析液触及滤液线。

5、色素分离后，及时用注射器将层析液吸回，进行观察。

改进二：简易色素分离装置

实验装置如图所示

操作步骤：

1、将画好滤液线的滤纸条插入胶塞的切口处。

2、将3 ml层析液倒入锥形瓶中，将有滤纸条的胶塞插入亮扰镇锥形瓶中。

3、色素分离后，及时将滤纸条取出，待滤纸条干燥后进行观察。

三种色素分离装置的对比

实 验 装 置

优 点

缺 点

用烧杯进行色素分离

操作简单

层析液的挥发量较大，对学生的身体健康产生不利影响。

用试管进行色素分离

可减少层析液的挥发

需试管架固定，层析液的量不好控制。

自制密闭式色素分离器

操作简单，美观大方，经久耐用，色素分离和观察的全过程在密闭容器内进行，防挥发性能强。

没有现成的设备，需要重新生产、配置。

简易色素分离装置

①比用试管操作简单、容易固定；

②层析液的挥发量比用烧杯小很多。

③ 可用现成的设备组装，立即推广。

必须将滤纸条取出干燥，只能一定程度降低有毒气体挥发。