实验室柱层析实验装置图

1. 仪器分析——层析技术二、层析法实验技术

（一）凝胶层析法

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化斗旦晌性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。

⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的空锋层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。

⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。

凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。

⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。

⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

如果不迟碰再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

⒍凝胶层析的应用

⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

（二）离子交换层析法

离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：

C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1

式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。

洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。

⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

2. 气相色谱仪的结构可分为什么

气相色谱辩洞仪的结构可分为什么？

气相色谱仪主要有气路系统、进样系统、分离系统、温控系统和检测记录系统等组成。

一、气路系统：

包括气源、气体净化、气体流速控制和测量。为获得纯净、流和缓速稳定的载气。

二、进样系统：

包括进样器和气化室唤灶模。进样器分气体进样器和液体进样器，气化室是将液体样品瞬间气化的装置。

三、分离系统：

根据各组分在流动相和固定相中分配系数或吸附系数的差异，使各组分在色谱柱中得到分离。

四、温控系统：

控制气化室、柱箱和检测器的温度。

五、检测记录系统：

将各组分的浓度或质量转变成电信号并记录。

3. 离子交换层析的具体操作

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。 已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建议用0.02%叠氮钠。

4. 如何手动绘制色谱图

需要以下步骤：
1、准备好实验所需的色谱柱和其他实验装置。
2、誉渣准备样品，将样品注入到色谱柱中。
3、通过宽慎所使用的色谱分离方式，将样品分离出来。
4、通过检测设备（如紫外可见光谱仪）检测每个分离物的峰值。
5、在一张横坐标为保留时慎虚敬间，纵坐标为检测信号的图表上，手动绘制出每个分离物的峰值，用不同颜色或符号表示不同的组分。

5. 气相色谱原理

如果哪天有人问气相色谱原理？气相色谱是用来做什么？如果你告诉他气相色谱仪可以用来分离混合物并确定物质的量，它主要功能是分离和测试样品中的不同组分。你肯定会收到第二个问题。为什么气相色谱仪可以分离混合物并确定物质的含量？.....如果你再次回答，那将成为《十万为什么》的生活版本。您如何轻松描述关于气相色谱的这些问题的？不如就直接发这个文档给他吧！

原 理：

色谱分析是一种多组份混合物的分离、分析工具。

它主要利用物质的物理性质对混合物进行分离，测定混合物的各组份。并对混合物中的各组份进行定量、定性分析。

气相色谱仪是以气体作为流动相（载气）。当样品被送入进样器后由载气携带进入色谱柱。由于样品中各组份在色谱柱中的流动相（气相）和固定相（液相或固相）间分配或吸附系数的差异。在载气的冲洗下，各组份在两相间作反复多次分配，使各组份在色谱柱中得到分离，然后由接在柱后的检测器根据组份的物理化学特性，将各组份按顺序检测出来。

1气相色谱是什么？它分几类？

凡是以气相作为流动相的色谱技术，通称为气相色谱。一般可按以下几方面分类：

1、按固定相聚集态分类：

（1）气固色谱：固定相是固体吸附剂，

（2）气液色谱：固定相是涂在担体表面的液体。

2、按过程物理化学原理分类：

（1）吸附色谱：利用固体吸附表面对不同组分物理吸附性能的差异达到分离的色谱。

（2）分配色谱：利用不同的组分在两相中有不同的分配系数以达到分离的色谱。

（3）其它：利用离子交换原理的离子交换色谱：利用胶体的电动效应建立的电色谱；利用温度变化发展而来的热色谱等等。

3、按固定相类型分类：

（1）柱色谱：固定相装于色谱柱内，填充柱、空心柱、毛细管柱均属此类。

（2）纸色谱：以滤纸为载体，

（3）薄膜色谱：固定相为粉末压成的薄漠。

4、按动力学过程原理分类：可分为冲洗法，取代法及迎头法三种。

2气相色谱的分离原理是什么？

气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。

3气相色谱法的一些常用术语及基本概念解释？

1、相、固定相和流动相：

一个体系中的某一均匀部分称为相；在色谱分离过程中，固定不动的一相称为固定相；通过或沿着固定相移动的流体称为流动相。

2、色谱峰：

物质通过色谱柱进到鉴定器后，记录器上出现的一个个曲线称为色谱峰。

3、基线：

在色谱操作条件下，没有被测组分通过鉴定器时，记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。

4、峰高与半峰宽：

由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高，一般以h表示。色谱峰高一半处的宽为半峰宽，一般以x1／缓昌2表示。

5、峰面积：流出曲线（色谱峰）与基线构成之面积称峰面积，用A表示。

6、死时间、保留时间：

从进样到惰性气体峰出现极大值的运哪团时间称为死时间，以td表示。从进样到出现色谱旁橘峰最高值所需的时间称保留时间，以tr表示。

7、死体积，保留体积：

死时间与载气平均流速的乘积称为死体积，以Vd表示，载气平均流速以Fc表示，Vd=tdxFc。保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积，以Vr表示，Vr=trxFc。

8、保留值与相对保留值：

保留值是表示试样中各组分在色谱柱中的停留时间的数值，通常用时间或用将组分带出色谱柱所需载气的体积来表示。以一种物质作为标准，而求出其他物质的保留值对此标准物的比值，称为相对保留值。

9、仪器噪音：基线的不稳定程度称噪音。

10、基流：氢焰色谱，在没有进样时，仪器本身存在的基始电流（底电流），简称基流。

4一般选择载气的依据是什么？气相色谱常用的载气有哪些？

作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；

纯度高；

价格便宜并易取得；

能适合于所用的检测器。

常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气、二氧化碳气等等。

5载气为什么要净化？应如何净化？

所谓净化，就是除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质，以提高载气的纯度。不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定器线性变劣等，所以载气必须经过净化。

一般均采用化学处理的方法除氧，如用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采用矽胶，分子筛等吸附剂除水分。

6试样的进样方法有哪些？

色谱分离要求在最短的时间内，以“塞子”形式打进一定量的试样，进样方法可分为：

1.气体试样：大致进样方法有四种：

（1）注射器进样

（2）量管进样

（3）定体积进样

（4）气体自动进样。

一般常用注射器进样及气体自动进样。注射器进样的优点是使用灵活，方法简便，但进样量重复性较差。气体自动进样是用定量阀进样，重复性好，且可自动操作。

2.液体试样：

一般用微量注射器进样，方法简便，进样迅速。也可采用定量自动进样，此法进行重复性良好。

3.固体试样：

通常用溶剂将试样溶解，然后采用和液体进样同样方法进样。也有用固体进样器进样的。

7简述在气相色谱分析中各种操作条件对检测结果的影响？

操作条件对于色谱分离有很大影响。

1、柱长，柱内径：

一般讲，柱管增长，可改善分离能力，短则组分馏出的快些；

柱内径小分离效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致担体不能均匀地分布在色谱柱中。

2、柱温：

是一个重要的操作变数，直接影响分离效能和分析速度。选择柱温的根据是混合物的沸点范围，固定液的配比和鉴定器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；

降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。

一般采用等于或高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱温，不易挥发的样品采用高柱温。

3、载气流速：

载气流速是决定色谱分离的重要原因之一。一般讲流速高色谱峰狭，反之则宽些，但流速过高或过低对分离都有不利的影响。

4、固定相：

固定相是由固体吸附剂或涂有固定液的担体构成。

当用同等长度的柱子，颗粒细的分离效率就要比粗的好些。

固定液含量对分离效率的影响很大，它与担体的重量比一般用15％－25％。比例过大有损于分离，比例过小会使色谱峰拖尾。

5、进样：

一般讲进样快，进样量小，进样温度高其分离效果好。对进液体样，速度要快，汽化温度要高于样品中高沸点组分的沸点值，一次汽化，保证色谱峰形不致展宽、使柱效高。当进样量在一定限度时，色谱峰的半峰宽是不变的。若进样量过多就会造成色谱柱超载。

一般讲柱长增加四倍，样品的许可量增加一倍。

8什么叫担体？对担体有哪些要求？

担体是一种多孔性化学惰性固体，在气相色谱中用来支撑固定液。对担体有如下几点要求：

1.表面积较大；

2.具有化学惰性和热稳定性；

3.有一定的机械强度，使涂渍和填充过程不引起粉碎；

4.有适当的孔隙结构，利于两相间快速传质；

5.能制成均匀的球状颗粒，利于气相渗透和填充均匀性好；

6.有很好的浸润性，便于固定液的均匀分布。

完全满足上述要求的担体是困难的，人们在实践中只能找出性能比较优良的担体。

9担体分几类？其特点如何？

通常分为硅藻土和非硅藻土两大类，每一类又有种种小类。

1、硅藻土类型：

（1）白色的：表面积小，疏松，质脆，吸附性能小，经适当处理，可分析强极性组分；

（2）红色的：有较大的表面积和较好的机械强度，但吸附性较大。

2、非硅藻土类型：

（1）氟担体：表面惰性好，可用来分析高极性和腐蚀性物质，但装柱不易，柱效率低些。

（2）玻璃微球：表面积小，用它做担体柱温可以大大降低，而分离完全且快速。但涂渍困难，柱效低。

（3）多孔性高聚物小球：机械强度高，热稳定性好，吸附性低，耐腐蚀，分离效率高，是一种性能优良的新型色谱固定相。

（4）炭分子筛：中性，表面积大，强度高，祛寿命长，在微量分析上有无比的优越性。

（5）活性炭：可以单独做为固定相。

（6）沙：主要用于分离金属。

10常用的担体怎样选择？

各种担体，名目繁多。在常用硅藻土担体中：

红色担体（如6201、201），可用于非极性或弱极性物质的分离。

白色担体（如101）可用于极性物质或碱性物质。

釉化红色担体（如301）可用于中等极性物质。

硅烷化白色担体可用于强极性氢键型物质如废水测定。

分离酸性物质，如酚类，要用酸洗处理的担体。

分离碱性物质，如乙醇胺，要用碱洗处理的担体。

有些特殊的情况下要用特殊的担体，如氟担体分离异氰酸酯类。

但是在普通的常量分析中，对担体可以不必过份讲究，甚至如耐火砖粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。

11何谓固体固定相？大体可分为几类？

指直接装填到色谱柱中作为固定相的具有活性的多孔性固体物质。固体固定相大体可分为三类：

第一类是吸附剂。如：分子筛、硅胶、活性炭、氧化铝等；

第二类是高分子聚合物。如国内的GDX型高分子多孔微球，国外Porapak系列等；

第三类是化学键合固定相。在气相色谱中，通常是将固定液涂敷在载体表面上。

采用化学键合固定相分析极性或非极性物质通常都能够得到对称峰，柱效很高，固定相的热稳定性也有所改善。

12什么是固定液？对固定液有哪些要求？

一般是一种高沸点的有机物的液膜，通过对不同组份的不同分子间的作用，使组份在色谱柱中得到分离。对气相色谱用的固定液，一般有如下几点要求：

1.在操作温度下蒸气压低，热稳定性好，与被分析物理或载气不产生不可逆反应；

2.在操作温度下呈液态，而且粘度愈低愈好。物质在高粘度的固定液中传质速度慢，柱效率因而降低。这决定固定液的最低使用温度；

3.能牢固地附着在载体上，并形成均匀和结构稳定的薄层；

4.被分离的物质必须在其中有一定的溶解度，不然就会很快地被载气带走而不能在两相之间进行分配；

5.对沸点相近而类型不同的物质有分离能力，即保留一种类型化合物的能力大于另一种类型。这种分离能力即是固定液的选择性。

13固定液的选择原则有哪些？

根据被分离组分和固定液分子间的相互作用关系，固定液的选择一般根据所谓的“相似性原则”，即固定液的性质与被分离组分之间的某些相似性，如官能团、化学键、极性、某些化学性质等，性质相似时，两种分子间的作用力就强，被分离组分在固定液中的溶解度就大，分配系数大，因而保留时间就长；反之溶解度小，分配系数小，因而能很快流出色谱柱。

下面就不同情况进行讨论：

a、分离极性化合物，采用极性固定液。这时样品各组分与固定液分子间作用力主要是定向力和诱导力，各组分出峰次序按极性顺序，极性小的先出峰，极性越大，出峰越慢；

b、分离非极性化合物，应用非极性固定液，样品各组分与固定液分子间作用力是色散力，没有特殊选择性，这时各组分按沸点顺序出峰，沸点低的先出峰。对于沸点相近的异构物的分离，效率很低；

c、分离非极性和极性化合物的混合物时，可用极性固定液，这时非极性组分先馏出，固定液极性越强，非极性组分越易流出；

d、对于能形成氢键的样品。如醇、酚、胺和水的分离，一般选择极性或氢键型的固定液，这时依组分和固定液分子间形成氢键能力大小进行分离。

“相似相容性原则”是选择固定液的一般原则，有时利用现有的固定液不能达到满意的分离结果时，往往采用“混合固定液”，应用两种或两种以上性质各不相同的，按适合比例混合的固定液，使分离有比较满意的选择性，又不致使分析时间延长。

14色谱柱失效后有哪些表现？其失败原因是什么？

色谱柱失效主要表现为色谱分离不好和组分保留时间显著变短。色谱柱失效的主要原因是：对气固色谱来说是固定相的活性或吸附性能降低了，对气液色谱来说，是使用过程中固定液逐渐流失所致。

15毛细管柱的老化操作

老化的目的：气相色谱柱的固定相通常是以涂覆的形式分布在柱管管壁内侧（毛细管柱）或载体表面（填充柱）上的，对于一根新的气相色谱柱，外层固定相与载体的结合往往较弱，在高温下使用会缓慢流失，造成基线起伏和噪声升高，为了避免这一现象发生，可以预先在较高温度下（一般为色谱柱的耐受温度）加热一段时间，使结合较弱的固定相挥发出去，从而使后面的分析不受干扰。此外，对使用时间较长的气相色谱柱可进行老化操作，可以除去色谱柱中残留的污染物。

将色谱柱柱温升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于操作温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱，此外不要将程序升温的速度设定的太慢。

当达到老化温度后，记录并观察基线。比例放大基线，以便容易观察。初始阶段，基线应持续上升，在到达老化温度后5-10 分钟开始下降，并且会持续30-90 分钟。当达到一个固定的值后，基线就会稳定下来。如果在2-3 小时后基线仍无法稳定或在15-20 分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或污染。

遇到这样的情况，应立即将柱温降至40℃以下，尽快地检查系统并解决相相关的问题。如果还是继续地老化，不仅对色谱柱有损害，而且始终得不到正常稳定的基线。另外，老化的时间也不宜过长，不然会降低色谱柱的使用寿命。

一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间较长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT 色谱柱的老化方法又各不相同，具体步骤请参阅随柱子的操作说明书。

如果在色谱柱没有与检测器连接就进行老化，那么老化后，谱柱末端部分可能已被破坏。要先把柱末端10-20cm 部分截去，再将色谱柱连接到检测器上。温度限定是指色谱柱能够正常使用的应用温度范围。如果操作温度低于色谱柱的温度下限，那么分离效果和峰形都不会很理想。但这样对色谱柱本身并无什么损害。

温度上限通常有两个数值。数值较低的是恒温极限。在此温度下，色谱柱可以正常使用，而且无具体的持续时间限制。较高的数值是程序升温的升温极限。该温度的持续时间通常不多于十分钟。高于温度上限的操作则会降低色谱柱的使用寿命。

16基线漂移问题排查

在GC 中使用程序升温时常常会出现基线漂移的现象，这种现象通常有以下几个原因：色谱柱流失、进样垫流失、进样器污染或检测器污染、气体流速的变化。如果使用高灵敏度检测器，即便是微弱的柱流失或系统污染都可能带来显著的基线漂移现象。为了提高定性和定量分析的可靠性，应尽可能的降低或消除基线漂移。

17如何降低样品和进样器带来的基线漂移？

色谱柱上如果有高分子不挥发性物质残留，那么在程序升温时就容易产生基线漂移，因为这些物质的保留较强，在柱中移动缓慢，可以采用重新老化的方法将这种强保留组分从柱子上赶出，但这种方法增加了固定液氧化的可能性；

此外，还可以使用溶剂冲洗色谱柱（冲洗之前请阅读柱子的使用注意事项,以便选出合适的溶剂）；

也可以安装保护柱，这样可以预防问题发生。如果是进样器被污染造成基线漂移，可以通过更换进样垫、衬管和密封圈来解决，同时用溶剂冲洗进样口，维护完毕之后，用一段熔融石英管将进样器和检测器连接起来，进一针空样，以确认进样器已经干净。

18如何降低检测器带来的基线漂移？

由检测器带来的基线漂移通常是由补偿气或者燃气当中少量的烃类物质引起的，使用高纯气体净化器处理补偿气或者燃气可以减少这种基线漂移；使用高纯气体发生器可以改善FID 的基线稳定性；正确的检测器维护，包括定期的清洗，都可以减少这种漂移。

19如何降低柱子流失带来的基线漂移？

在使用新柱之前，按照以下方法老化可以使柱流失降到：用高于实验操作温度20℃或者用色谱柱的操作温度（使用两者中较低者）来老化，长时间低温老化相对于短时间高温老化有利于降低色谱柱流失。如果在载气当中含有少量的氧气或者水分或者气体管路漏气，在高温条件下，固定液就容易被氧化，从而造成柱流失，带来基线漂移。

一旦固定液被氧化，必须使用高纯载气老化数小时，才有可能使基线趋于水平，这种对固定液的破坏是无法弥补的，所以如果有氧气连续通过色谱柱，即便进行老化基线也无法降到水平。因此，在实验过程中，应在气体管路当中使用高质量的氧气/水分过滤器，同时用高质量的电子检漏仪严格检漏。

20无峰

1.FID检测器火焰熄灭；

2.进样器的气化程度太低，样品未能汽化；

3.柱温过低使样品冷凝在色谱柱中；

4.进样口漏气；

5.色谱柱入口漏气或堵塞；

6.进样针的问题，取不上样品。

21所有组分峰小或变小

可能原因和建议措施：

1.进样针缺陷，使用新针；

2.进样后漏液，判断漏液点；

3.分流比过大；

4.分析物质分子量过大，提高进样口的温度；

5.NPD被污染物(二氧化硅)覆盖 更换铷珠；

6.NPD温度过高(使用或环境温度)，气体不纯 ，更换铷珠：避免高温使用；

7.检测器与样品不匹配。

22前延峰

1.峰伸舌多为色谱柱过载，减小进样量，使用大容量柱子；

2.提高OVEN，INJ温度；

3.增大载气流速；

4.掌握进样技巧；

5.前次样品在色谱柱中凝聚，未能及时出尽；

6.试样与固定相载体有反应。

23峰高、峰面积不重复

1.进样不重复，偏差大；

2.其他峰型变化引起的峰错位；

3.基线的干扰；

4.仪器系统参数设定的改变，参数标准化，规范化；

5.色谱柱性能改变。

24连续进样时灵敏度重复性差

在连续进样的条件下，峰面积忽大忽小，测定精度不高，原因如下：

1.进样技术差；

2.载气泄漏或流速不稳；

3.检测器沾污；

4.色谱柱，衬管被污染，清洗衬管，用溶剂(优级纯甲醇)清洗色谱柱：更换之(如有必要)；

5.注射器有泄漏；

6.进样量超过检测器线性范围形成检测器过载。

25峰拖尾

1.衬管，色谱柱被污染或者衬管，色谱柱安装不当，存在死体积，注射甲烷，峰若拖尾，则重新安装；

2.进样器温度过高；

3.色谱柱柱头不平 用金刚砂切割；

4.固定相的极性指标与样品不匹配，换匹配的柱子；

5. 样品流通路线中有冷井，消除路线中的过低温度区；

6.衬管或色谱柱中有堆积切割碎屑 清洗更换衬管，切除柱头10cm；

7. 进样时间过长；

8.分流比低，增大分流比(至少大于20/1)；

9.进样量过高，减小进样体积或稀释样品。

26分离度下降

1.色谱柱被污染；

2.固定相被破坏(柱流失)；

3. 进样失败，检查泄露；

4.检查温度的适应性，检查衬管；

5.样品浓度过高，稀释，减少进样量，用高分流比。

27溶剂峰拉宽

1.色谱柱安装失败；

2.进样渗漏；

3.进样量高 提高汽化温度；

4.分流比低 提高分流比；

5.柱温低；

6.分流进样时，初始OVEN过高 降低初始柱温，使用高沸点溶剂；

7.吹扫时间过长(不分流进样) 定义短时间的吹扫程序。

28基线向下漂移

1.新安装的柱子，基线连续向漂移几分钟，继续老化；

2.检测器未达到平衡，延长检测器的平衡时间；

3.检测器或GC系统中其他部分有沉积物被烤出来，清洗之。

29基线向上漂移

1.色谱柱固定相被破坏；

2.载气流速下降，调整载气压力。

30噪音

1.毛细管柱插入检测器太深，重新安装色谱柱；

2.使用ECD，TCD气体泄露引发基线噪音，检查，维修气路；

3.FID ，NPD ，FPD燃气流速或燃气选择不当，高纯燃气，调整流速；

4.进样口被污染 清洗进样口，更换搁垫，更换衬管中的玻璃纤维；

5.毛细管色谱柱被污染，切除首端10cm，用溶剂清洗色谱柱，更换之；

6.检测器发生故障。

31提高分离度的几种方法

1.增加柱长可以增加分离度；

2.减少进样量（固体样品加大溶剂量）；

3.提高进样技术防止造成两次进样；

4.降低载气流速；

5.降低色谱柱温度；

6.提高汽化室温度；

7.减少系统的死体积，比如色谱柱连接要插到位，不分流进样要选择不分流结构汽化室；

8.毛细管色谱柱要分流，选择合适的分流比。

综上所述要根据具体情况在实验中摸索，比如降低载气流速、降低色谱柱温度又会使色谱峰变宽，因此要看色谱峰型来改变条件。最终目的是达到分离好，出峰时间快。

32如何确定色谱柱老化是否完全?

FID检测器最适合用于检测色谱柱老化时的基线。在升温程序的末端，基线将升高，然后基线下降逐渐平稳，此时可以认为色谱柱老化完成。

当色谱柱处于高温时，柱寿命急剧下降。如果色谱柱老化时超过2小时还有大量柱流失，则将色谱柱冷却至室温，辨认柱流失来源如：氧气渗入、隔垫漏气和仪器本身的残留物。

柱流失：在色谱柱老化之后做柱流失实验，不进样跑一次程序升温，从50℃开始升温 10℃/min到色谱柱最高使用温度，并在最高温度保持10min 出来的色谱图即为柱流失图，拿这张图跟今后空白对比。

如果在空白运行中产生了很多峰，则色谱柱性能改变，这可能是由于载气中含有氧气，也可能是由于样品残留。如果有 GC-MS，则低极性色谱柱的典型流失离子（例如 DB/HP-1 或 5）质/荷比 m/z 将为 207、73、281、355 等，大多数为环硅氧烷。

一般认为柱流失能引起噪声和不稳定的基线。真正的柱流失常常有如同噪声状的正向漂移。看看基线是否向上较大漂移，空白有无峰流出等。

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6. 蛋白质层析、超滤常用技术手段

在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰(见图6－2)。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操作时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18%；吸附损失为1.69%；透过损失为1.23%；截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。目前国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。
随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .

为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.

7. 气相色谱仪的使用方法，及使用注意事项应用范围

气相色谱仪使用方法怎样？

1 、开氮气、氢气、空气发生器电源开关（或氮气瓶总阀），调节输出压力稳定在0.4Mpa左右（气体发生器一般在出厂时调整，无需调整）。

2 、将色谱仪气体净化器的气体开关打开至“开”位置。观察色谱柱载气后B的柱前压力上升并稳定约5分钟后，打开色谱仪的电源开关。

3 、设定每个工作部件的温度。 TVOC分析的条件设置：（a）烤箱：烤箱初始温度50°C 、初始时间10分钟、加热速率5°C / min 、结束温度250°C 、结束时间10分钟； （b）注射器和检测器：均为250°C。用于脂肪酸分析的色谱条件：（a）烘箱：烘箱的初始温度140°C 、初始时间5分钟、加热速率4°C / min 、终止温度240°C 、终止时间15分钟； （b）进样器温度为260°C检测器温度为280°C。

4 、点火：待测试（按“显示、 Shift 、检测器”检查检测器温度）温度升至150°C以上后，将净化器上的氢气、空气开关阀打开至“ON”位置。观察到色谱仪上的氢气和空气压力表分别稳定在0.1 Mpa和0.15 Mpa左右。按住点火开关（无点火时间为6~8秒）进行点火。同时，明亮的金属片靠近探测器出口，当火开启时，金属片上会有明显的水蒸气。如果氢气在6~8秒内未点火，则松开点火开关并重新点火。在点火操作期间，如果发现水在检测器出口中的白色聚四氟乙烯盖中冷凝，则可以拧下检测器收集器盖并移除水。确定色谱工作站上是否点燃氢火焰的方法：观察氢火焰点燃后的基线电压应高于点火前的基线电压。

5 、打开电脑和工作站（通道1分析脂肪酸，通道2分析碘），打开方法文件：脂肪酸分析方法或碘分析方法。显示屏左下角应该有一个蓝色文字，以显示当前的电压值和时间。然后，您可以转动色谱仪放大器面板上点火按钮上的“粗调”旋钮，检查信号是否为路径（当您转动“粗调”旋钮时，基线应该会改变）。在基线稳定后，输入样品并单击“开始”按钮或单击色谱仪旁边的快捷按钮以分析色谱数据。在分析结束时，单击“停止”按钮，数据将自动保存。

6 、关闭程序：首先关闭氢气和空气源，使氢火焰探测器灭火。在氢气火焰熄灭后，将炉子初始温度、检测器温度和进样器温度设置为室温（20-30°C）。温度降至设定温度后，关闭色谱仪电源。最后关掉氮气。

8. 气象色谱柱怎么接

转载：《分析测试网络网》

气相色谱柱的安装
色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。 正确的安装请参考以下步骤：

步骤1.

检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。

步骤2.

将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端要小心切平

步骤3.

将色谱柱连接于进样口上色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm，这就是较为理想的状态。(具体的插入程度和方法参见所使用GC的随机手册)避免用力弯曲挤压毛细管柱，并小心不要让标记牌等有锋利边缘的物品与毛细柱接触摩擦，以防柱身断裂受损。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后(用手拧不动了)用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。因为不紧密的安装，不仅会引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。

步骤4.

接通载气当色谱柱与进样口接好后，通载气, 调节柱前压以得到合适的载气流速(见下表)。

柱前压设置为Psi

15m 25m 30m 50m 100m

0.20mm 10-15 20-30 18-30 40-60 80-120

0.25mm 8-12 13-22 15-25 28-45 55-90

0.32mm 5-10 8-15 10-20 16-30 32-60

0.53mm 1-2 2-3 2-4 4-8 6-14

(以上仅为建议的起始设置，具体数值要依据实际的载气流速。)将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。

步骤5.

将色谱柱连接于检测器上其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。

步骤6.

确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。

步骤7.

色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。

对色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。

一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同。 PLOT柱的老化步骤:HLZ Pora 系列 250℃， 8小时以上Molesieve(分子筛) 300℃ 12小时Alumina(氧化铝) 200℃ 8小时以上由于水在氧化铝和分子筛PLOT柱中的不可逆吸附，使得这两种色谱柱容易发生保留行为漂移。当柱子分离过含有高水分样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。

步骤8.

设置确认载气流速对于毛细管色谱柱，载气的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛细管色谱柱，那么依照载气的平均线速度(cm/sec),而不是利用载气流量(ml/min)来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值：氮气：10-12cm/sec 氢气：20-25cm/sec载气杂质过滤器在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时，最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。

步骤9.

柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验(不进样)。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持 10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会增高。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他：色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。

注意：当空气中氢气的含量在4-10%时，就有爆炸的危险。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。

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9. 安捷伦气相色谱柱怎么安装的，能帮我安装下吗

气相色谱柱只有正确的安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。安装过程如下：
1.检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等，检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。
2.将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端要小心切平。
3.将色谱柱连接于进样口上。色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm，这就是较为理想的状态。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。
4.当色谱柱与进样口接好后，通载气。将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。
5.将色谱柱出口端连接于检测器上。其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。
6.通载气，再对色谱柱的安装进行检查。注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。
7.色谱柱的老化。色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。
对色谱柱升至一恒定温度，可加热至高于最高使用温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。当柱子分离过含有高水分样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。
8.柱流失检测。在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。（比如：如果在正常的使用状态下，基线的信号值增高，那么可能色谱柱的性能开始下降。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和GC系统有污染。）

10. 乙苯脱氢制苯乙烯实验报告色谱图怎么看

乙苯脱氢实验报告

脱氢实验报告乙苯脱氢制苯乙烯实验乙苯脱氢催化剂

篇一：乙苯脱氢制苯乙烯实验思考题

（1）乙苯脱氢生成苯乙烯反应是吸热还是放热反应？如何判断？如果是吸热反应，则反应温度为多少？本实验采用的什么方法？工业上又是如何来实现的？答：乙苯脱氢生成苯乙烯反应是吸热反应。反应温度升高，平衡向生成乙苯的方向移动。反应温度为540℃。本实验采用采用的方法是接通电源使汽化器、反应器分别逐步升温至预定温度。汽化器温度达到300度，反应器温度达400度左右开始加入已校正好流量的蒸馏水。当反应度达到500度左右时，加入已校正好流量的乙苯，继续升温至540度使之稳定。加热温度用热电偶控制。工业上乙苯脱氢时常加入适量O2，在合适的条件下，O2与生成的H2化合成H2O，相当于移走生成物H2，促进平衡向生成苯乙烯的方向移动。

（2）对本反应而言使体积增大还是减小？加压有利还是减压有利？工业上使如何来实现加减压操作的？本实验采用什么方法？为什么加入水蒸气可以降低烃的分压？

1

答：乙苯脱氢生成苯乙烯为体积增加的反应。从平衡常数与压力的关系可知降低总压P总可使Kn增大，从而增加反应的平衡转化率，故降低压力有利于平衡向脱氢方向移动。工业上，通过加水蒸气和乙苯的混合气来实现减压操作。本实验采用加水蒸气的方法来降低乙苯分压以提高平衡转化。因为水蒸气热容量大；产物易分离；产物不起反应；水蒸气还可以保护裂解炉管；水蒸气还有清焦作用。

（3）在本实验中你认为有哪几种液体产物生成？哪几种气体产物生成？如何分析？

答：液体产物：苯乙烯、乙苯、苯、甲苯。

气体产物：甲烷、乙烷、乙烯、氢气、二氧化碳、（水蒸气）

（4）进行反应物料衡算，需要一些什么数据？如何收集并进行处理？

答：进行反应物料衡算需要乙苯的和水的加入量，精产品水层量和烃层量，并对粗产品中苯、甲苯、乙苯和苯乙烯含量进行分析，从而计算乙苯的转化率、苯乙烯的先择性和收率。

篇二：乙苯脱氢制苯乙烯

实验报告

课程名称：化工专业实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：乙苯脱氢制苯乙烯实验类

型：____ _同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）七、讨论、心得

一、实验目的

1、了解以乙苯为原料，氧化铁系为催化剂，在固定床单管反应器中制备苯乙烯的过程。

2、掌握乙苯脱氢操作条件对产物收率的影响，学会获取稳定的工艺条件的方法。册链

3、掌握乙苯脱氢制备苯乙烯的转化率、选择性、收率与反应温度的关系；找出最适宜的反应温度区域。

4、学会使用温度控制和流量控制的一般仪表、仪器。

5、了解气相色谱分析及使用方法。

二、实验内容和原理

1、本实验的主副反应

主反应：C6H5C2H5?副反应：

C6H5C2H3?H2

C6H5C2H5?C6H6?C2H4C6H5C2H5?H2?C6H6

C6H5C2H5?H2?C6H5CH3?C2H4

在水蒸气存在的条件下，还可能发生下列反应：C6H5C2H5?2H2O?

C6H5CH3?CO2?3H2

此外还有芳烃脱氢缩合及苯乙烯聚合生成焦油。这些连串

副反应的发生不仅使反应的选择性下降，而且极易使催化剂表面结焦进而活性下降。

2、影响本反应的因素：(1) 温度的影响

乙苯脱氢反应为吸热反应,△H00，从平衡常数与温度的关系式??lnKpH0可知，提高温度州迅孙可增大平衡

2

T

P

RT

常数，从而提高脱氢反应的平衡转化率。但是温度过高副反应增加，使苯乙烯选择性下降，能耗增大，设备材质要求增加，故应控制适应的反应温度。本实验的反应温昌咐度为540~600℃。(2) 压力的影响

乙苯脱氢为体积增加的反应，从平衡常数与压力的关系式K

Kn

p当△γ0时，降低??总?可知，?n?

i??

P

总压P总可使Kn增大，从而增加了反应的平衡转化率，故降低压力有利于平衡向脱氢方向移动。本实验中

加水蒸气的目的是降低乙苯的分压，以提高乙苯的平衡转化率。较适宜的水蒸气用量为：水：乙苯=1.5:1（体积比）或8：1（摩尔比）。(3) 空速的影响

乙苯脱氢反应系统中有平行副反应和连串副反应，随着接触时间的增加，副反应也增加，苯乙烯的选择性可能下降，故需采用较高的空速，以提高选择性。适宜的空速与催化剂的活性及反应温度有关，本实

-1

验乙苯的液空速以0.6h适宜。

3、催化剂

本实验实用GS-08催化剂，以Fe，K为主要活性组分，添加少量的IA，IIA，IB族以稀土氧化物为助剂。

三、实验装置、实验准备物料及仪器

1、乙苯脱氢制苯乙烯实验装置流程见下图：

1-水计量管；2-乙苯计量管；3、4进料泵；5-气化室；6-反应室；7-冷凝器；8-集液罐；9-H2流量计；10-N2流量计；11-湿式气体流量计；12-N2压力表

2、药品：乙苯（分析纯）1瓶；瓶蒸馏水一桶；氮气一钢瓶

3、实验器具：电子天平一台；色谱一台（测液体浓度）；秒表一只（或用手机等其他代替）100ml量筒2个；100ml 烧杯4个；100ml分液漏斗2个；1ug色谱取样管2个

四、操作方法和实验步骤

1、实验任务：测定不同温度下乙苯脱氢反应的转化率、苯乙烯的选择性和收率，考察温度对乙苯脱氢反应转化率、苯乙烯选择性和收率的影响。

2、主要控制指标：

（1）汽化温度控制在300℃左右，（2）反应器前温度控制在500℃，（3）脱氢反应温度为540℃、600℃，（4）水：乙苯=1.5:1（体积比）。

（5）控制乙苯加料速度为0.5ml/min，蒸馏水进料速度为0.75ml/min。3、具体操作步骤

（1）了解并熟悉实验装置及流程，搞清物料走向及加料、出料方法。

（2）仪表通电，待各仪表初始化完成后，在各仪表上设定控制温度：汽化室温度控制设定值为300℃、反应器前温度控制为500℃，反应器温度控制值为540℃。

（3）系统通氮气：接通电源，系统通氮气，调节氮气流量为20l/h。

（4）汽化器升温，冷却器通冷却水：打开汽化室加热开关，汽化室逐步升温，并打开冷却器的冷却水。（5）开反应器前加热和反应器加热：当汽化器温度达到200℃后，打开反应器前加热开关和反应器加热开关。

（6）开始通蒸馏水并继续通氮气：当反应器温度达400℃

时，开始加入蒸馏水，控制流量为0.75ml/min，氮气为10l/h。

（7）停止通氮气加乙苯：当反应器内温度升到540℃左右并稳定后，停止通氮气，开始加入乙苯，流量控制为0.5ml/min。

（8）记下乙苯加料管内起始体积，并将集液管内的料液放空。

（9）物料在反应器内反应50分钟左右，停止乙苯进料，该通氮气，流量为10l/h。并继续通蒸馏水，保持汽化室和反应器内的温度。

（10）记录此时乙苯体积，算出原料加入反应器的体积：（11）将粗产品从集液管内放入量筒内静置分层。

（12）分层完全后，用分液漏斗分去水层，称出烃层液体质量。

（13）量取少量烃层液样品，用气相色谱分析组成，并计算出各组分的百分含量。

（14）改变反应器控制温度为600℃，继续升温，当反应器温度升至600℃左右并稳定后，再次加入乙苯入反应器反应，重复之前操作，并记录相关数据。

（15）反应结束后，停止加乙苯。反应温度维持在500℃左右，继续通水蒸气，进行催化剂的清焦再生，约半小时后停止通水，停止各反应器加热，通氮气清除反应器内的氢气，并使实验装置降温。实验装置降温到300℃以下时，可切断

电源，切断冷却水，停止通氮气，整理好试验现场，离开实验室。（16）对实验结果进行分析讨论。

五、实验数据记录和处理

表1实验数据记录表

计算示例：

以温度为540℃为例进行计算

乙苯加入量：FF=(39.1?11.6)×0.867=23.8425g

乙苯消耗量：RF=23.8425?20.3371×0.623037=11.1717g 苯乙烯生成量：P=20.3371×0.351317=7.1448g 乙苯转化率：α=

RFFF

×100%=

P/M1RF/M0

11.171723.8425

×100%=46.8562%

×100%=65.1843%

苯乙烯选择性：S=×100%=

7.1448/10411.1717/106

苯乙烯的收率：Y=α×S×100%=0.468562×0.651843×100%=30.5429%

六、实验结果与分析

1、乙苯转化率和温度关系

实验中温度升高，乙苯转化率增大。乙苯脱氢反应为吸热反应，?H0，从平衡常数与温度的关系式

??lnKp??H0可知，提高温度可增大平衡常数，从而提高脱氢反应的平衡转化率。TRT2??P

2、苯乙烯选择性与温度关系

实验中升高温度，苯乙烯选择性降低。温度升高使副反应增加，苯乙烯选择性下降。从产物色谱图可以看出，600℃下色谱图中有四个明显的峰，而540℃下的色谱图中仅苯乙烯、乙苯的峰较明显。3、苯乙烯收率

实验中升高温度，苯乙烯收率增加。

七、讨论、心得

1、由温度升高后乙苯的转化率增大，确定该反应是吸热。适度的升温有利于主反应的进行，但随着温度升高，副反应增加，使苯乙烯选择性下降；且温度过高，能耗增大，设备材质要求增加。因而不是反应温度越高越好。

2、乙苯脱氢为体积增加的反应。从平衡常数与压力的关系式

KP?Kn

p

总?可知，当△γ0时，降?n?

i??

低总压P总可使Kn增大，从而增加了反应的平衡转化率，故减压有利于平衡向脱氢方向移动。本实验中加蒸馏水是为了产生水蒸气，目的是降低乙苯的分压，以提高乙苯的平衡转化率。不能用自来水代替蒸馏水。3、试验中生成的苯乙烯、苯、甲苯在常温下为液态，而生成的氢气、二氧化碳、乙烷、乙烯为气态。可根据产物沸点来判定。篇三：4乙苯脱氢4-6小时

实验十一乙苯脱氢与产物分离实验

一、实验目的：

1、了解以乙苯为原料，氧化铁系为催化剂，在固定床单管反应器中制备苯乙烯的过程。

2、学会稳定工艺操作条件的方法。

3、掌握乙苯脱氢制苯乙烯的转化率、选择性、收率与反应温度的关系；找出最适宜的反应温度区域。

4、了解气相色谱分析方法。

二、实验原理：

1、本实验的主副反应

乙苯脱氢生成苯乙烯和氢气是一个可逆的强烈吸热反应，只有在催化剂存在的高温条件下才能提高产品收率，其反应如下：主反应：C6H5C2H5 副反应：C6H5C2H5

C6H5C2H3 + H2 C6H6 + C2H4

C2H4 + H2 C2H6

C6H5C2H5 + H2 C6H6+ C2H6C6H5C2H5 C6H5－CH3+ CH4

此外，还有部分芳烃脱氢缩合、聚合物以及焦油和碳生成。

2、影响本实验的因素（1）温度的影响

乙苯脱氢反应为吸热反应，△H

?H??lnKP?

0，从平衡常数与温度的关系式

RT??T?P

02

可知，提高

温度可增大平衡常数，从而提高脱氢反应的平衡转化率。但是温度过高副反应增加，使苯乙烯选择性下降，能耗增大，设备材质要求增加，故应控制适应的反应温度。（2）压力的影响

乙苯脱氢为体积增加的反应，从平衡常数与压力的关系式KP△γ0时，降低总压P

总可使

P总?

Kn

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可知，当

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乙苯脱氢实验报告
乙苯脱氢实验报告

脱氢实验报告乙苯脱氢制苯乙烯实验乙苯脱氢催化剂

篇一：乙苯脱氢制苯乙烯实验思考题

（1）乙苯脱氢生成苯乙烯反应是吸热还是放热反应？如何判断？如果是吸热反应，则反应温度为多少？本实验采用的什么方法？工业上又是如何来实现的？答：乙苯脱氢生成苯乙烯反应是吸热反应。反应温度升高，平衡向生成乙苯的方向移动。反应温度为540℃。本实验采用采用的方法是接通电源使汽化器、反应器分别逐步升温至预定温度。汽化器温度达到300度，反应器温度达400度左右开始加入已校正好流量的蒸馏水。当反应度达到500度左右时，加入已校正好流量的乙苯，继续升温至540度使之稳定。加热温度用热电偶控制。工业上乙苯脱氢时常加入适量O2，在合适的条件下，O2与生成的H2化合成H2O，相当于移走生成物H2，促进平衡向生成苯乙烯的方向移动。