做激光共聚焦扫描显微镜实验用的样品装置

『壹』 激光共聚焦显微镜的工作原理是什么如何准备流式细胞的实验样品

采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称薯拿键为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的敏并光，可以会聚在探测孔范围之数巧内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

『贰』 激光扫描共聚焦荧光显微镜的激光扫描共聚焦显微镜基本结构

激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。
激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：
半导体激光器：405nm（近紫外谱线）
氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光）
氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器）633nm （红光—氦氖红激光器）
UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光） 风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。
激光扫描共聚焦荧光竖凳显清碧微镜相对普通荧光显微镜的优点（1）：LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理：（2）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；（3）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径：（4）LSCM除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷阱技余正旅术、荧光漂白后恢复技术等。

『叁』 激光扫描共聚焦显微镜的激光共聚焦显微镜结构

激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
在结构 配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分 [2]。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”（Optical sectioning）、三维重建、动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。此外，CLSM 对荧光样品的观察具有明显的优势，只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

『肆』 可以与激光共聚焦扫描显微镜联用的仪器有

共聚焦拉曼成像仪。与激光共聚焦扫描显微镜进行联用的是共聚焦拉曼成像仪。激光迟御共聚焦扫描显微镜是在荧光显微镜成象的基础上加装激光册培扫描装置，使用紫外光或可见光激发州旦唯荧光探针的仪器。

『伍』 共聚焦的共焦显微

共焦显微技术是由美国科学家M.Minsky在1957年提出的，当时的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。20世纪60年代通过提高扫描精度突破了普通宽场成像的分辨率限制，在20世纪80年代研制成商用共焦显微镜。共焦显微镜分为普通光照明激发和激光照明激发两种类型，而以后者应用最为广泛。
激光扫描共聚焦显微镜（Lsaer scanning confocal microscope，LSCM）是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。 它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙旦帆等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。 激光扫描共聚焦显微镜工作原理
激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近为0%），因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干扰，使得它具有比普通显微镜更高的分辨率，并在生物学中获得了广泛的应用。 共聚焦扫描显微镜
共聚焦显微镜主要由五部分组成：显微光学系统、扫描装置、光源、检测器和应用软件系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。（1）显微光学系统：
显微镜是共焦检测系统常用的组件，是系统成像质量的核心部分。显微镜光路一般采用无限远光学系统结构，可以方便地在其中插入光学元件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径、平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换、滤色片组的选取、载物台的移动调节、焦平面的记忆锁定等都可以由计算机自动控制。
（2）扫描装置：
扫描装置是激光共聚焦检测系统进行大范围检测必需的组件，通常有由丝杠导轨组成的XY平移扫描、由阵镜摆动的扫描等方式。前种扫描方式可以实现大范围区域的扫描，而后者扫描范围相对小一些，不过阵镜摆动扫描可以很快，图像数尺采集速度可以大大提高，有利于对那些寿命短的离子作荧薯迟高光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制，与信号采集相对应。
（3）光源：
光源有单色光（激光）和多色光（汞灯、氘灯、卤素灯等）。激光源可以使用多谱线氩离子激光器，它提供发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光；另外，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器提供波长为633nm的红光。激光源还可以用其他半导体激光器。
（4）检测器：
检测器通常采用光电倍增管（PMT）、光子计数器等，通过高速A/D转换器，将信号输入计算机以便进行图像重建和分析处理。通常在PMT前设置针孔，可以采用固定大小针孔或由计算机软件来控制的可变大小针孔。如果是检测荧光，光路中还应该设置能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要；也可以采用光栅或棱镜分光然后进行光谱扫描。
（5）应用软件系统：
应用软件系统可以根据具体需要设置各种功能，但有一点是共同的，就是将扫描位置坐标与检测器接收的信号一一对应起来，并以图像的方式进行储存与显示。 共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展，扫描方式从最初的狭缝扫描方式（扫描速度较快，图像分辨率不高），到阶梯式扫描技术（提高了图像分辨率，标本制备要求太高），再到驱动式光束扫描器（扫描速度较快，符合共聚焦原理）。另外，激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进，主要集中在如下几个方面：
（1） 现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。选择激光光源时，一方面要满足研究工作对波长的需求，另一个方面要考虑到激光光源的寿命。
（2）最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术，配上合适的激光源后，能够摆脱传统的波长滤片组的限制，连续和自由地选择最佳波长。
（3）用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进，不但具有平场复消色差特性，而且能与高速扫描功能相匹配。
共焦显微镜发展至今又产生了新的类型，如针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜：
（1）针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜：
针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜是为了解决快速变化过程的共聚焦检测问题而提出的，其核心是双碟片专利技术，由日本Yokogawa Electric公司发明，包括微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转。
与常规激光共聚焦方法不同，针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜采用CCD作为探测器，无需载物台进行扫描运动，只要微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转，就可以对物体进行快速共焦检测，最高全幅采集帧速度达到1000帧/s，是活细胞在体荧光成像的重要工具。
（2）双光子共聚焦显微镜：
双光子共聚焦显微镜
双光子共聚焦显微镜是为了解决生物检测中样品染料标记的光漂白现象而提出的，因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，这样就要求激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色（即光漂白现象），荧光信号会随着扫描进程的进行变得越来越弱。除此之外，还有光毒作用问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。针对活性样品的研究，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象将使这些研究受到很大的限制。
双光子激发原理
双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个较低能量（即更长的波长）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个能量较高（即波长为长波长一半）的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子共聚焦显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
双光子共聚焦显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子共聚焦显微镜比普通共聚焦显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞，或用来进行定点光漂白实验。 共聚焦显微镜有较高的分辨率，而且能观察到样本随时间的变化。因此，共聚焦显微技术在生物学研究领域起着不可或缺的作用。以下为共焦显微技术的几个主要应用方面：
（1）组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测：
利用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片”，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本，特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。
（2）定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化：
激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。
（3）荧光光漂白及恢复技术：
利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。
（4）长时程观察细胞迁移和生长：
激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。
（5）其他的生物学应用：
用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。

『陆』 2020-02-12小刘科研笔记之激光共聚焦原子力显微镜

形貌、成分和结构的表征是材料的生长、鉴别、加工、研究和应用等过程中很重要的一个步骤。本篇笔记将以华慧高芯网激光共聚焦原子力显微镜为例描述该设备在材料表征的功能与应用。

激光共聚焦原子力显微镜具有常规光学显微镜、激光显微镜、原子力显微镜三种功能，常规光学显微镜和激光显微镜同轴，其中激光显微镜采用405nm激光光源，平面X、Y分辨率能达到120nm，可进行小尺寸的样品测试且便于原子力测试时进行样品定位。

图2 和3分别为激光显微镜获得的光刻胶图形和聚合物划痕的三维形貌握橘察图。

如图1所示，小尺寸样品进行激光成像测量。同时，激光下具有三维成像、粗糙度测量、粒子分析等功能。对于尺寸和粗糙度较大等不适用于原子力测试时，可选择采用激光测量。

图2 和3分别为激光显微镜获得的光刻胶图形和聚合物划痕的三维形貌图。

激光共聚焦显微镜是在普通光学显微镜的基础上对成像原理作了改进，加装了激光扫描装置，同时利用计算机成像处理技术提高成像分辨率 。

如图4所示，激光共聚焦显微镜是使激光扫描束通过光栅孔形成点光源，在焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管，经过信号处理形成图像。

由于激光光源的光栅针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的，因此针孔只接受扫描聚焦点光斑处信息，能够对样品的深层次进行观察，鉴定，通过对连续层次上的共聚焦图像处理， 可以实现真正的三维图像重段茄建 。

原子力显微镜具有很高的平面和深度测量精度，在纳米尺度测量范畴具有广泛的应用。 不仅仅能够观察表面形貌特征，还能获取准确的数值形式的表面高低起伏状态，对表面整体形象的分析得到样品表面的粗糙度，颗粒度、孔结构和孔径分布等参数。广泛用于半导体、高分子聚合物、生物科学等行业。

                                                                                                          ▲图5. 纳米片样品的AFM测试

                                                                                                             ▲图6. 金属薄膜的三维形貌

                                                                                                           ▲图7. 聚合物三维形貌图

                                                                                                           ▲图8. 碳材料三维形貌图

如图9所示，AFM就是将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微伍盯悬臂轻微变形，这样微悬臂的微小变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了 通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。

 

AFM有三种工作模式： 接触模式、非接触模式、轻敲模式。

接触模式 分辨率高，但易“拖刮”损伤样品表面，且还会由于探针与样品表面产生的粘滞力造成图像失真；

非接触模式 可以避免上述问题，但由于探针与样品表面距离较远、作用力太小，造成分辨率降低，且可能因表面张力干涉而造成图像变形；

轻敲模式 是一种较为先进的模式，它是采取探针垂直样品表面高频振动，交替的让针尖与样品表面“接触”和“抬高”。这种模式结合了上述的两种优点，既不损伤样品表面又有较高的分辨率。

1.具有高分辨能力，测试对样品无损伤。

2.AFM利用原子间的范德华力来呈现样品的表面特性。 因此，AFM除导电样品外，还能观测非导电样品的表面结构，且不需要用导电薄膜覆盖，其应用范围更为广阔。

3.具有很宽的工作范围 ，可以在真空、空气、常温、低温、高温等环境下扫描成像。

4.样品制备简单 ，样品不需要包埋、覆盖、染色等处理，可直接观察。

1.针尖易磨损和受污染，磨损无法修复，污染难以清洗。

2.扫描范围小 ，容易将局部的、特殊的结果当做整体的结果分析，结果缺乏重现性。

虽以此设备为例，但设备原理均大同小异，只是精度不同，故可根据实际需求选择。

不积珪步，无以至千里；不积细流，无以成江海。做好每一份工作，都需要坚持不懈的学习。