⑴ 21.下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法,请回答下列问题:
（1）透析（粗分离） 分子量较小 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液 （2）②③④① 完全进入凝胶层 关闭 ⑶aa相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
⑵ 求问怎么用离子交换树脂层析分离混合氨基酸
【原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱 (＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。
【材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)
2．实验试剂
(1)2mol／L HCl
(2)2mol／L NaOH
(3)0.1mOl／L HCl
(4) 0.1mol／L NaOH
(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml
(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加 0.2mol／L HAc 30ml
(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮
(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m【方法】
1. 树脂的处理
100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。
2. 装柱取直径0.8cm～1.2cm、长度 10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
3. 加样、洗脱及洗脱液收集
打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。
在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。
于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集 (注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。
最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以 -，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
【注意事项】
1. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。
2. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。
⑶ 血红蛋白凝胶过滤层析所需仪器、用具、物品和实验的具体方案
一、实验目的
1.了解凝胶柱层析的原理及应用；
2.掌握凝胶柱层析的基本操作技术，为进一步掌握离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离方法打下良好的基础。
二、实验原理
凝胶层析：原理与应用
凝胶层析又称凝凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
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凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav值。而凝胶床总体积Vt可用测量法得到：
由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即
Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi
而Vo和Vi可通过实验测得：当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0－1之间）。
以床体积Vt（等于pr2h）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kav，若以床体积Vt（等于Vo+Vi）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kd。在同一层析条件下，对同一物质计算出来的Kav和Kd值尽管有一定的差异性，但都是有效的。只因Kav计算方便，所以目前多使用Kav。分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。
反应原理
凝胶过滤不仅常用做物质的分离，还可以根据需要用某种试剂非常方便地处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，再与过量的试剂分开。本实验就是通过凝胶过滤，用还原剂FeSO4处理血红蛋白。即首先在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，随着还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合又形成了鲜红的血红蛋白。铁氰化钾则因分子量小，在层析柱中呈现其本来的黄色带而远远地落在血红蛋白的后边。本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼观察即可检验分离效果。
三、实验材料
1.器材：层析柱，?10×200
2.试剂：
(1) 20mM磷酸二氢钠
(2) 20mM磷酸氢二钠
(3) 40mM FeSO4(用时现配)
(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA
(5) 抗凝血（哺乳动物血样，以1：X的比例加入%柠檬酸钠，置于4℃冰箱中保存。贮存期以不超过3个月为宜）
(6) Sephadex G-25
(7) 固体铁氰化钾
四、仪器设备
铁架台、恒流泵
五、实验步骤
1．凝胶的处理 取3克葡聚糖凝胶（Sephadex-25）干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀（室温，6小时），然后倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，最后加入等体积pH7磷酸缓冲液继续浸泡（磷酸缓冲液用试剂1、2以39:51的比例混合，并用pH计校对）。
2．装柱 将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边到入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。
3．平衡 用磷酸缓冲液洗脱，平衡20分钟。注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。
4．血红蛋白样品的制备 取1ml抗凝血于烧杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/ml。
5．层析柱还原层的形成 取1ml 40mMFeSO4于小烧杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液搅拌均匀。待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，速取该混合液0.4ml加入层析柱中，待混合液完全进入柱床后加入0.7ml缓冲液。（注意还原剂的混合液要新鲜配制，尽可能缩短在空气中暴露的时间）。
6．上样 将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝,取前面制备好的血红蛋白样品0.5ml，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内。
7．洗脱 用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每5秒一滴的流速，观察并记录实验现象。
8．清洗 待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱5min
⑷ 举例说明三种柱层析的原理
问问
5．举例说明三种柱层析的原理
5．举例说明三种柱层析的原理 3. 试述细胞融合技术在细胞生物学研究中的应用
最佳答案
在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 二、 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 三、 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 四、 亲和层析 亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析
⑸ 求离子交换柱层析法和拥有分子筛作用的（叫什么忘了）的两个实验报告或操作详细说明
离子交换层析
Tina 发表于 2006-2-21 12:21:00
材料与仪器
DEAE-32纤维素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎离心后的上清液；
层析柱
二、 方法与步骤
1） 装柱：
用水清洗层析柱，柱内留存水距底部约1cm，加入18ml介质（凝胶溶液）。
2） 平衡：
加0.01M,PH8.0,tris-HCl缓冲液，直至流出液PH与缓冲液一致。
3） 上样：
用量筒量出上清液体积，再加入等体积缓冲液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至刚好覆盖凝胶表面，靠璧缓慢加样。
4) 用50ml缓冲液洗涤，用EP管随机收集样品穿出液和洗涤穿出液。
5) 洗脱：
将梯度洗涤仪和层析柱连接，洗脱瓶A（混合器）加200µl缓冲液，开口打开至两瓶液面相平，相通管道出无气泡，关闭连接，A中加入6gNaCl溶解，把装置放在梯度混合仪上，开动搅拌器开关，打开A和B的连接通道，层析柱下端连收集器，收集洗脱流出液。
6） 控制流速，约4min/管，2-3ml/管。
分子筛的是凝胶层析
Sephadex G-100凝胶层析
Tina 发表于 2006-2-21 12:27:00
材料与仪器
Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，浓缩液
层析柱
二、 方法与步骤
1） Sephadex G-100 凝胶预处理
a) 100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。
b) 倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
c) 将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。
2) 装柱
a) 层析柱(1.0Î50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有2 cm的水。从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
b) 搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
c) 凝胶沉积到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。
3） 平衡
柱装好后，使层析床稳定15-20分钟，然后连接洗脱瓶出口和层析柱顶端，用3-5倍体积地缓冲液平衡层析柱。平衡过程中控制上柱缓冲液地进柱操作压保持恒定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH与上柱缓冲液完全相同。
4） 样品洗脱
a) 上样准备：
i) 上样前打开层析柱上端，先检查凝胶床界面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将凝胶床界面轻轻搅起后，再使凝胶自然沉降，形成平整状态的凝胶床界面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出凝胶床界面。
ii) 样品放入高速离心机，12000r/min、离心5 min。
iii) 上样前吸取50µl样品于EP管中，以备走电泳。
b) 样品上样：
i) 将样品由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。同时打开层析柱下面流出液开关（控制流速1滴/20秒），保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致，控制凝胶床界面不能脱水，并控制样品区带尽量狭窄。
ii) 当1.5ml样品全部加入后，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脱液同上样时一样地保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致以控制凝胶床界面不能脱水，小心清洗凝胶床界面表面，使黏附着的样品全部洗入凝胶床。
iii) 然后开始控制上样的滴速大于层析柱下面流出滴速，使几乎与凝胶床界面相平的洗脱液液面慢慢提高至凝胶床界面高出2cm左右，封闭层析柱上端。
iv) 保持层析柱上柱洗脱液入口处与层析柱下面流出处有一定势压。控制上柱缓冲液的进柱操作压保持恒定。
c) 洗脱：
用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液洗脱，用部分收集器收集，4分钟/管（约2-3ml/管），收集约1-30管。
5） 酶活、酶浓度测定，参见2.6.2，2.6.3
6） 最高酶活收集管洗脱液留50µl，以备走电泳。
7） 将酶活较高的收集液10~14管合并，测定总体积为7.1 ml，精确测定酶活性。并用考马思亮蓝测定蛋白浓度。测酶活时体系稀释了200倍，定蛋白时无稀释。
⑹ 做柱层析时，装柱子的过程，是怎样的
加填料的时候要轻轻敲打柱子 这样柱子能装的比较实 柱子装不实的话 可能就白过了
⑺ 请问做柱层析的硅胶怎么做预处理啊，怎么装柱
硅胶的预处理:以浓盐酸浸泡硅胶，然后用蒸馏水洗涤硅胶后，将起进行减压抽滤，后不断加蒸馏水冲洗。使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后，在110℃烘箱中活化2小时。
第二、活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时，宜使用口径较大的玻璃漏斗置于 层析柱上部，注入1/2高的石油醚，打开下部活塞，然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗，这样可以防止层析柱中形成断层(这一步是实验的关键步骤)。
装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。
也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。
上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量 芗 洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法 关于TLC和柱层析之我的体会(转)
柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。
柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀 释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。
接下来谈TLC，需要切记的是：
第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。
第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。
选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。
一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。
对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里 在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种 难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点 一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示： A X B C D
这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的 点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为 有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。
利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只 显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别 的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。