配置緩沖液實驗裝置

『壹』 聚丙烯醯氨凝膠電泳的實驗材料

一．設備
進行凝膠電泳的裝置見圖版4。
1）直流電源如果一次進行電泳的管數在20管以內可以用最大電流300毫安的整流器（硅或硒整流器），調壓范圍0—300伏。
2）電泳裝置包括二個緩沖液槽和電泳 管。液槽可以用玻璃或塑料製成，在底部鑽孔。插入電泳管，用有孔橡皮塞固定。電泳管選用孔徑均勻一致的玻璃管切制。長10厘米，內徑 ^5毫米。脫色用玻璃管長10厘米，內徑8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。
3）凝膠管架灌裝凝膠管時使管保持垂直位置，用有機玻璃製成。
二．操作方法
1）凝膠管的制備將電泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然後灌入新配的凝膠溶液（方法見下文）。每管加至液體高度為7．5厘米。為了保證凝膠表面平整可用注射器通過細針頭小心地加一層（高約1厘米）蒸餾水於表面上，勿使與凝膠液混合，室溫放置。如果條件合適溶液於 30—60分鍾內聚合而成凝膠。凝膠溶液的配製方法如下：溶液甲：丙烯醯胺（氯仿重結晶）25克，雙體（甲醇重結晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要時用三羥甲基氨基甲烷調pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羥甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析純0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚劑以延緩凝聚時間。使操作方便，如凝聚時間已足夠長可以用蒸餾水代替。溶液丁：過硫酸銨（二級）2．8克加水至 100毫升新配。必要時用氨水調pH至7．0 c， 溶液甲及乙配後可在冰箱中保存數月。溶液丙及丁用時新配。臨用前將溶液甲、乙、丙、丁等量混合。
2）准備把已灌裝凝膠的玻管通過有孔椽皮塞安裝在上面液槽的底孔中，在上下兩槽內分別注入緩沖液。裝上後電泳管下端應浸沒在下槽的緩沖液中，管下端勿留氣泡。血清電泳可以用巴比妥緩沖液pH一8．6，離子強度0．05（配法：巴比妥鈉10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，溫熱使溶。加硫柳汞0．1克防霉）。
3）加樣在資料介紹的方法中，一般還在了這一步。在血清樣品中加入少量蔗糖以增加密度，用血紅蛋白吸管直接小心地加在凝膠表面上，加樣量一般為7微升血清。如果在樣品中混入少量溴酚蘭指示劑就可以在電泳過程中觀察前沿移動的情況。
4）電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負極在上。接通電源進行電泳，電場強度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時宜用較低的電壓以免發熱過度影響分離。蛋白質向正極移動。侍染料前沿移動至管底近處，停止電流。電泳時間為1一2小時。電泳完畢取下凝膠管，用細長針頭沿管壁注蒸餾水，使凝膠與管壁剝開。然後用橡皮球壓出凝膠條。
5）染色及脫色電泳後的凝膠條在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定並染色1小時以上。染色後的凝膠條用7%醋酸洗滌數次。置於脫色玻管中，在同一電泳裝置中電解脫色。此時改用7%醋酸充裝在液槽中。通電後過剩凝膠之上再加一層大孔凝膠，樣品聚合在最後的另一層凝膠中（圖2）。在我們的試驗中省略的染料泳向正極。脫色時電場強度25伏/厘米，電流10—1 5毫安/管。3—4小時脫色完畢。增高電壓可以加速脫色。有色的醋酸溶液通過盛有活性炭的漏斗過濾，即可除去染料，重新使用。
6）保存與記錄脫色後的凝膠可以裝在盛有7%醋酸的有塞試管中保存數年。也可以自然乾燥後保存，在需要觀察時再浸在7%醋酸中溶脹成原來形狀。記錄可以用照相攝影。也可以用光密度計進行捕記。光密度計的分辨力決定於其狹縫寬窄及光電管放大倍數。
三、實驗結果
1．電泳條件的選擇
為了選擇血清蛋白電泳較合適的條件，我們分別對單體濃度、雙體濃度、配製凝膠時所用不同正離子、各種電壓、二甲氨基丙腈的濃度、過硫酸銨的濃度等條件進行了試驗。根據以上試驗結果，我們在分離血清蛋白時選用的條件是：單體濃度6.25-6.5%，雙體占總丙烯醯胺量的4—5%，正離子採用三羥甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及過硫酸銨濃度分別為0.25%及0.7%。電泳電壓以7—10伏/厘米較為合適。但電泳時間較長，約2—3小時，室溫低時可以電壓稍高。如果室溫較高則可以在冰箱中進行電泳。
2．人血清及其酒精分劃部分的凝膠電泳
採用上述條件我們進行了正常人血清的凝膠電泳。一般可以分成15—20條區帶。我們也根據RaFmand介紹的兩向電泳方法比較了紙電泳和凝膠電泳各區帶的相對關系。紙電泳上的a：區帶在凝膠電泳中可被分離成10條以上區帶。但紙電泳中d，區帶的一部分則與凝膠電泳中自蛋白區帶相重合。二種電泳方法所得的圖譜見圖版9。在正常人血清中後白蛋白（PA）、轉鐵蛋白(Tr）和觸珠蛋白（HP）均有不同的型， 一例骨髓瘤病人血清的和凝膠電泳自由電泳圖譜的比較見圖版11、12。我們也比較了酒精分劃人血漿各部分的紙電泳和凝膠電泳圖譜，結果見圖版13。從圖中可見在紙上電泳檢定時看來較純晦白蛋白和丙種球蛋白部分，在凝膠電泳中可見明顯的其他蛋白區帶。
3．放射病狗血清蛋白電泳的觀察 放射病動物血清蛋白的改變可以在紙電泳中觀察到。一般認為狗在照射後吻球蛋白有增高。用凝膠電泳觀察可以得到更深入的資 料。正常狗血清的凝膠電泳圖譜大致與人相 似。狗受致死量照射後第九天有明 顯變化，至極期時則可以觀察到鴨、Tr、融及 sp等區帶有明顯增高。我們用胎3—10型光 譜儀用光密度計將電泳圖譜進行了掃描，所得 結果見圖3，圖版14。由於儀器的限制光縫 最小隻能達到0．5毫米，從而影響了其分辨力。但與正常血清對比可以見到其改變的情況，這 遠比紙電泳中所見更為明顯。我們認為如果聯 系臨床表現對變化的本質進行一些研究，將有 助於了解放射病極期來到前後體內蛋白質代謝的一些情況。
4．在分離正常人尿DNase時的凝膠電泳 觀察 用葡聚糖凝膠分離人尿中DNase時可以除去大部分其他蛋白質和雜質。但分離所得的製品用凝膠電泳觀察還可以見到五條以上的蛋白質區帶（見圖版14）。將凝膠條在未染色前置於含大分子DNA的瓊脂平板上，在37c』溫箱中保溫2—3小時，再用5%三氯醋酸加至如此處理過的瓊脂板上，可以看到乳白色本底上出現被酶水解後的透明斑點。將凝膠條用氨黑染色後顯示其蛋白區帶的位置。二者比較就可以確定具有酶活性的成分的相應電泳位置。我們的試驗中觀察到人尿DNase在凝膠電泳中至少被分離成二條以上有酶活性的區帶。說明有同功酶的可能。應用這一方法可以較深人地觀察體液中酶的情況。同時也說明可以用凝膠電泳來指示生物制劑制備過程中純化的情況。
四、結 論
本文介紹了聚丙烯醯胺凝膠電泳的一些初步實驗條件和實驗結果，並與紙電泳、自由電泳等進行了對比。從結果中可以看到聚丙烯醯胺凝膠電泳的分辨力較強，重演性良好。它在臨床生化分析及生物活性物質的分離、制備中和純度鑒定中具有較廣泛應用的可能性。

『貳』 某科研小組為探究植物光合作用速率的變化情況，設計了由透明的玻璃罩構成的小室（如圖A所示）．（1）將該

（1）影響光合作用的因素主要有光照強度、溫度、二氧化碳濃度等．圖A是密閉裝置，內有二氧化碳緩沖液，說明實驗過程中二氧化碳濃度始終不變，那麼影響小室內植物光合作用速率變化的主要環境因素就只有光照強度和溫度了．裝置刻度管中液滴移動是由氧氣的增減造成的，只在有氧氣釋放，液滴就會右移．圖B中g點表示光合作用與呼吸作用相等，超過該點將消耗氧氣，所以g點時儲存氧氣最多．
（2）表格中數據表明，氧氣的產生速率在逐漸減小，在B曲線上所對應的區段是de和fg．
（3）d點與c點相比，d點的氧氣釋放速率快，即光合速率快，消耗的C₃多，那麼C₃的生成量就多，暗反應發生在葉綠體基質中．
（4）用裝置A測定的光合作用的速率比實際值偏低，原因是植物進行呼吸作用消耗了部分氧氣．如果要測定該植物真正光合作用的速率，還需要測定出呼吸速率，具體做法是設置A裝置完全相同的C裝置，將C裝置遮光放在與A相同的環境條件下．測得單位時間內，實驗組讀數為M，對照組讀數為N，該植物真正光合作用的速率是=凈光合速率+呼吸作用速率=M-N或M+|N|．
故答案為：
（1）光照強度、溫度18（或g）
（2）de或fg
（3）多葉綠體基質
（4）植物存在呼吸作用遮光M-N（M+|N|）

『叄』 為探究CO2濃度和光照強度對植物光合作用的影響，某興趣小組設計了如圖所示的實驗裝置若干組，利用緩沖液

A、組別1中沒有光照，液滴向左移2.24代表的是植物的呼吸作用，消耗了密閉小室內的氧氣，由於室溫維持在25℃，其他組別的呼吸作用保持不變，A正確；
B、組別6中在光照強度1500，CO₂濃度0.03時，既進行光合作用又進行呼吸作用，液滴向右移動9.00，植物光合作用產生氧氣量大於有氧呼吸消耗氧氣量，B錯誤；
C、組別2和3相比，CO₂濃度0.03時，光照強度分別是800和1000，限制液滴移動的主要環境因素是光照強度，C正確；
D、組別3和4相比，光照強度1000，CO₂濃度分別是0.03和0.05，限制液滴移動的主要環境因素是CO₂濃度，D正確．
故選：B．

『肆』 圖乙為利用圖甲實驗裝置測得植物B葉片在不同光照強度下某種氣體體積變化曲線圖．（1）本實驗所測量的氣體

（1）分析實驗裝置可知，裝置中設置的CO₂緩沖液能夠為葉片光合作用提供二氧化碳，因此裝置中氣體量的變化是氧氣量的變化．乙圖中可以看出，4klx的光照時光合作用大於呼吸作用，甲裝置中的氧氣增多，因此紅色液滴應該向右移動．P點時光照強度為0，葉片只進行呼吸作用，影響呼吸作用的主要外界因素是溫度．光照強度為8klx時，葉片達到光飽和點，對應的凈光合作用強度為8ml/h，圖中呼吸作用強度為4ml/h，因此1小時光合作用產生的氣體量為12毫升．
（2）表格中可以看出，隨著時間的推移，游離型的葉綠素含量升高，結合型的葉綠素含量降低，因此導致植物B葉片光合速率下降的主要原因是結合型葉綠素含量降低．在提取色素的過程中，為了研磨充分需加石英砂，為了防止色素被破壞需加入碳酸鈣，再利用酒精提取色素．色素只有在和類囊體相似的環境中才能產生氧氣，因此提取出來的色素在試管中不能產生氧氣．
故答案為：
（1）氧氣右溫度12
（2）結合型葉綠素含量降低石英砂、碳酸鈣、酒精不變

『伍』 圖甲為測定光合作用速率的裝置，在密封的試管內放一新鮮葉片和二氧化碳緩沖液，試管內氣體體積的變化可根

（1）二氧化碳緩沖溶液可維持甲中二氧化碳濃度的相對穩定，因此液滴的移動方向取決於甲中氧氣量的變化，由於光照強度由5漸變為2.5 千勒克斯時，呼吸作用速率等於光合作用速率，因此液滴不移動．
（2）對葉片來說，當光照強度為10千勒克斯時，光合強度大於呼吸強度，應圖丙中不存在的箭頭有ef．
（3）在圖乙中，為了獲得圖乙中-50mL/h的數據，則應對甲裝置進行改進，新裝置為把甲裝置中的二氧化緩沖液改為氫氧化鈉溶液，其他條件不變，測定呼吸作用應在黑暗條件下進行實驗．
（4）丁圖中在15℃時光照下二氧化碳的吸收量為2.5，呼吸作用釋放的二氧化碳為1，由於實線表示的是凈光合速率，因此總光合速率=凈光合速率+呼吸速率=3.5，因此光合作用製造的有機物量是呼吸消耗有機物量的3.5倍．
（5）丙圖中由同一個細胞產生的葡萄糖徹底氧化分解利用，從葉綠體到線粒體會穿過4層膜，丙圖表示某植物的部分細胞結構和相關代謝情況，a～f代表O₂或CO₂，圖中c，d不可以表示ATP的去向，原因是葉綠體產生的ATP僅供暗反應利用．
故答案為：
（1）原始
（2）ef
（3）把甲裝置中的二氧化緩沖液改為氫氧化鈉溶液，其他條件不變 黑暗或遮光
（4）3.5
（5）4 葉綠體產生的ATP僅供暗反應利用