實驗室標准聚合反應裝置

Ⅰ 在塔式聚合反應器中，聚苯乙烯聚合裝置中，預聚合的目的是什麼是否可以省去這一步驟為什麼

不可以省略，因為預聚合是促進聚合反應的利用效率
如果省略了，就會影響到生產的效率

Ⅱ 聚合酶鏈反應的反應體系

PCR基本原理示意圖（如右圖）：
在一個典型的PCR反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2 和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環前模板預變性3～5min；在末次循環後，樣品仍需繼續延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便於了解PCR反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。 用於PCR的標准緩沖液見PCR操作範例。於72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近於7.2。二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產量。實驗表明，Mg2 優於Mn2 ，而Ca2 無任何作用。
1．Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L（當各種dNTP濃度為200mmol/L時），但並非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時，都要把Mg2 濃度調到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2 過量易生成非特異性擴增產物，Mg2 不足易使產量降低。
樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg2 結合而降低Mg2 有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶於10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。
dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標准反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低於1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg2 的濃度。
2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。
3．KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高於50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。
4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結果，影響不大。
5．二甲基亞碸（DMSO）在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利於減少DNA的二級結構，使（G C）%含量高的模板易於完全變性，在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數並不使用DMSO。 在PCR反體系中dNTP終濃度高於50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低於10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。
決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低於7.1。市購的游離核苷酸凍乾粉，溶解後要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。 典型PCR反應混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由於DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。
由於生產廠家所用兵配方、製造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，於74℃，30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。
分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巰基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標記及α-32P標記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。 單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。
DNA的大小並不是關鍵的因素，但當使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時），如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，則擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低於線狀DNA，因此，用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。
模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。 在實際工作中常採用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠（EB）（每100ml加100μl），然後將已經制備好的1%～2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配製）放入電泳槽內，加入待測樣品10μl，同時用分子量標准品作標記。瓊脂糖濃度應按分離DNA片段的大小進行選擇，一般用1.5%～2%，電泳電壓75V，待樣品進行凝膠內距膠末端1cm時，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結果。
由於溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結合物，在紫外燈下能發射熒光，使EB的熒光強度增強80～100倍，所以，電泳後凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察DNA量可達10ng，其熒光強度與DNA含量成正比。
DNA分子在凝膠中泳動速度決定於電荷效應及分子效應。前者由所帶凈電荷量決定，而後者與分子大小及構型有關。按照DNA分子大小，其凝膠濃度可做不同的調整。有條件的實驗室也可用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）分析擴增的DNA片段。 PCR技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然後才進行自動熱循環，最後進行產物鑒定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應中各種成份加入量和溫度循環參數均不一致。現將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度循環參數
在PCR自動熱循環中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作範例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算。在自動熱循環儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決於幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。
關於熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的（G C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度比擴增引物的融解溫度TTm低5℃，可按公式進行計算：
Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃
其中A，T，G，C分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果（G C）%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標准速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鍾可延伸1kb的長度，其速度取決於緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質。擴增片段如短於150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對於100～300bp之間的短序列片段，採用快速、簡便的雙溫循環是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對於1kb以上的DNA片段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長DNA片段。
4．循環次數常規PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環次數過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。當然循環反應的次數太少，則產率偏低。所以，在保證產物得率前提下，應盡量減少循環次數。
擴增結束後，樣品冷卻並置4℃保存。
二、引物引物設計
要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個鹼基，可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。有時可在5』端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的。有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G C）%含量引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的鹼基多聚體。兩個引物中（G C）%含量應盡量相似，在已知擴增片段（G C）%含量時宜接近於待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發夾結構（hairpinstructures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（Primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3』端配對DNA聚合酶是在引物3』端添加單核苷酸，所以，引物3』端5～6個鹼基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。
引物設計是否合理可用PCRDESN軟體和美國PRIMER軟體進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干後可保存1～2年。
三、DNA聚合酶
在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發現了DNA聚合酶，並且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性，並有3』→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個片段分子量為34000，具有5』→』3』外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有』3』→5』外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復制過程中校正功能有關。三是5』→3』外切酶活力，它能從5』端水解核苷酸，還能經過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。1985年Mullis 等發明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR後，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發展。人們從生活於60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應用於PCR。
1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應用的關鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產物和DNA二級結構對PCR的干擾，增進了PCR特異性、產量和敏感度，二者相比，其主要區別在於：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴增的產物並非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴格性提高，減少錯配引物的延伸。②循環後期酶量漸感不足而產生平坡。到達平玻的循環次數，Klenow酶為20個（均用1μg基因組DNA開始）而Taq酶為30個。③延伸片段長度Taq酶為10kb以內，而Klenow酶為400bp以內。
Taq酶由水棲高溫菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分離而得。此菌於1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標准菌株，其生長溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。後來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結合率（Kcat）可達150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃時Kact>60nt/s；55℃可達24nt/s；37℃時為1.5nt/s，而22℃時低至0.25nt/s。高於90℃時DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結合。
在PCR反應混合液中，Taq酶於92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時間分別為130、40及5～6min，在50次循環的PCR中當管內最高溫度為95℃。每循環為20s時尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環中選用的變性溫度，不宜高於95℃。
Taq酶現已可用基因重組的方法生產，商品名為Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達生產，含832個氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對dNTP結合，引物與模板作用區均存在於Taq酶中。
Taq酶具有依賴DNA合成的5』→』3』外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3』-磷酸化的「阻斷物」，會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，而對於5』-32P標記的合成寡核苷酸引物，則無論是單鏈或是與模板復性，都未發現降解，所以該種活性不會影響PCR結果。Taq酶沒有3』→』5』外切酶活性，如果發生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運用Taq酶進行PCR，產物中點突變較多，對克隆等不太有利。一般錯摻率為1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg2 為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3』→5』外切酶活性對測序有利。
2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg2 為2.0mmol/L時激活能力最高。濃度超過此值產生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力達40%～50%。dNTP能與Mg2 結合，故游離Mg2 只是結合後剩餘的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
dNTP濃度低時PCR產率及特異性均增高，適合於用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μlPCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。
用鯡精DNA，70℃，10min內dNTP的摻入量計算，標准條件為100%。
純9.4KDa Taq酶不含3』→5』核酸外切酶活力。誤摻入率取決於dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5』→3』核酸外切酶活力。對5』→3』32P標記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時均只有極少的降解力。
中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑製作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可產生中度抑制或無作用。
低濃度尿素、DMSO、DMF或甲醯胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑製作用。
3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將TaqDNA聚合酶的5』→3』外切酶活性片段（N端289個氨基酸）去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應即復合PCR（Multiplex PCR）更為有利。
VentTMDNA多聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent）中分離的超級嗜熱菌-能生長於98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學性質較Taq DNA聚合酶更為優越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，並且具有3』→5』外切酶活性的校正能力，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。後來該公司又從深水潛艇（2010m）排氣孔分離的能在104℃生長的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h）。
4．RTth逆轉錄酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆轉錄-PCR（RT-PCR）的發展很快，所以對耐熱的依賴於RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴於RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司於1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴於RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴於DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴於Mn2 Mg2 ，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利於逆轉錄PCR的發展。
耐熱DNA聚合酶的研究得到長足的發展，這在PCR發展中起到了重要的作用。相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應用更進一步地發展。
我國的PCR研究發展很快，其關鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化，如復旦大學遺傳學研究所、華美公司、中國醫學科學院基礎醫學研究所。後二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復旦大學遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因並獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學性質非常接近於Taq DNA聚合酶，為中國PCR的開展提供了保證。
四、影響PCR特異性的因素
通過上述內容。可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發夾結構時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2』-脫氧鳥苷-5』-三磷酸（7-deaza-2』-deoxyguanosine-5』-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產物的生成。
五、擴增平坡
擴增反應並不是可以無窮地進行下去的，經過一定的循環周期後需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進入平坡；進入平坡的循環次數，取決於起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環的後期，合成產物達0.3～1pmol時，由於產物的堆積，使原來以指數增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標准反應中均不會出現。此外，還有幾種可能：
1．底物過剩因DNA合成量多於反應液中存在的Taq酶，在100μl反應液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸）時，開始變為底物過剩。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之。但不實用，因每進行下一循環就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續保持指數增長。
2．非特異性擴增產物的競爭與上述情況密切相關，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應特異性，使不需要片段不能大量積聚。
3．退火時產物的單鏈自己締合兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會阻止產品增多。當產物濃度到達10pmol/100μl時即可發生此現象，除稀釋外無法克服。
4．變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及最終產物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。
總而言之，PCR的條件是隨系統的而異的，並無統一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然後稍稍改變各參數，可以達到優化，以取得優良的特異性和產率。

Ⅲ 標準的聚合酶鏈式反應過程分為哪三步

(1)DNA變性(90～96℃)：DNA雙螺旋結構的生物功能在於復制與轉錄，加熱或在鹼性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為DNA變性。解除條件後，變形的單鏈DNA可以重新結合起來，再形成雙鏈，稱之為DNA復性，又叫退火。DNA雙鏈離解一半時溫度稱為解鏈溫度(Tm)。不同DNA的解鏈溫度不同，取決於DNA中G—C與A—T的含量的區別。G—C間有3個氫鍵，A—T間有2個氫鍵，因此G—C比例大的DNA片段解鏈溫度高，一般，G—C含量每增加1％，PCR變性溫度增加0.4℃。Tm范圍通常一般在85—95℃之間，PCR變性溫度選擇90～94℃，變性時間為30秒到2分鍾；

(2)退火(25～65℃)：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈；

(3)延伸(70～75℃)：在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端一3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

DNA聚合酶鏈式反應（PCR）現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60～65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。PCR反應擴增出了高的拷貝數後，就要對擴增結果進行檢測。熒光素(溴化乙錠，EB)染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

PCR反應特異性強、靈敏度高、簡便、快速，對標本的純度要求低，不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用於臨床標本如血液、體腔液、洗漱液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

沙漠地區溫差大，平均年溫差可達30～50℃，日溫差更大，夏天午間地面溫度可達60℃以上，若在沙灘里埋一個雞蛋，不久便燙熟了。夜間的溫度又降到10℃以下。由於晝夜溫差大，達到60℃，因此，有利於植物貯存糖分，所以沙漠綠洲中的瓜果都特別甜。這還只是指空氣溫度而言，變化更為劇烈的是沙子表面的溫度。在炎熱的夏天，乾燥的沙子在中午強烈的日光照射之下，其溫度可以達到70℃。當夜色降臨的時候，沙漠表面沙子的溫度便開始下降，甚至可以降到10℃以下，僅一天之內的溫度變化，就已經超過70℃了。

沙漠中，雖然氣溫和地表溫度變化劇烈，但地下的溫度卻比較穩定。比如，同樣是在夏天，當表面的沙子一天之內溫差的變化達70℃時，在地下40cm深處的溫度變化只有5℃左右，而平均只是在25℃左右。在寒冷的冬天，地下的溫度也比氣溫和地表溫度高得多。有人曾經測量過，當沙子溫度高達66℃時，地面以下46cm的洞內，溫度僅為16℃。動物如果能夠躲進這個洞穴之中，那將是多麼涼爽啊！而且在洞穴內，濕度也比較高，這有助於動物減少體內水分的消耗和散失。

Ⅳ 聚合反應用到醋酸反應釜設備用什麼材質的

由於生產工藝、操作條件不盡相同，反應釜分為電加熱、蒸汽加熱、導熱油循環加熱，軸封裝置分為填料密封、機械密封、磁力密封。攪拌型式有錨式、漿式、渦輪式、推進式、自吸式、框式。 高壓釜的常規選材有:06Cr18Ni10(304)、06Cr18Ni11Ti(321)

Ⅳ 制聚合乙烯地反應條件和催化劑

乙醇制乙烯的反應中存在嚴重炭化現象！！
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實驗中存在的問題
實驗室制乙烯常採用乙醇和濃硫酸於170℃時的脫水反應。該實驗存在的主要問題是炭化比較嚴重，給實驗造成一些不利影響，主要有以下幾點：(1)由於大量乙醇被炭化使乙烯的產氣量減少。(2)伴隨乙醇炭化產生的大量s02不僅污染教學環境，對乙烯的性質實驗也有明顯干擾。(3)伴隨乙醇炭化還能發生一些更復雜的副反應，有資料稱該實驗還可能生成h2、ch4、co等氣體，致使點燃乙烯氣體時火焰顏色明顯發生變化，呈現出h2、co等氣體燃燒時特有的藍色，這也影響對乙烯性質的認識。總之，炭化是影響該實驗質量和效果的主要問題。
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消除炭化的思路
從上面分析不難看出，在實驗室制乙烯的實驗中主要存在兩個並行反應，一個是乙醇脫水生成乙烯，一個是乙醇炭化，這兩個反應都需，要硫酸的存在。乙醇脫水生成乙烯是非氧化一還原反應，硫酸只起催化劑的作用。乙醇炭化是氧化一還原反應，硫酸主要是氧化劑。前者對硫酸濃度要求不是很嚴格，後者對硫酸濃度的要求卻是很嚴格的，因為只有達到一定濃度時硫酸才具有氧化性。如果適當控制硫酸的濃度，就有可能做到在保證正常生成乙烯的前提下抑制乙醇炭化反應的發生。
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消除炭化的方法
從上面分析可以看出，控制硫酸濃度是消除炭化的關鍵。控制硫酸濃度可以從下面兩個方面採取措施。
3．1調整乙醇和醋酸的量比
在實驗室制乙烯的反應中乙醇和硫酸的量比為體積比1：3，用這樣的混和液進行反應炭化很嚴重，經常是反應溫度未達176℃時就已經開始炭化了，最後混和液中出現許多炭的顆粒。若將乙醇和硫酸的量比改為體積比1：2，硫酸被乙醇稀釋使濃度降低更多一些，炭化現象就有可能消除或減輕。實際情況也確實如此，當用這樣的混和液進行反應時開始並不炭化，只是反應在進行了一個短時間後才出現炭化現象，比原實驗減輕了許多。
3．2用化學反應控制硫酸的濃度
用改變乙醇和硫酸量比的方法並不能徹底消除炭化現象，這是因為在反應過程中乙醇不斷被消耗，反應生成的水也在加熱條件下不斷被蒸發，琉酸的濃度不斷增大，當硫酸的濃度增大到一定程度的時候，硫酸又具備了使乙醇發生炭化的條件，炭化現象就又發生了。由此可見硫酸濃度的增大是一個進行性過程，單純依靠在反應開始時改變乙醇和硫酸量比的方法是不能從始至終消除炭化的，必須增加一個消耗硫酸的反應，使硫酸和乙醇同步減少，這樣才有可能徹底消除炭化。這樣的反應必須具備兩個條件：①反應速度不能過快，若反應速度過快會造成硫酸的過度消耗，影響生成乙烯的反應正常進行。②反應生成物對乙烯的性質無影響。經多實驗發現，用大理石和硫酸反應可以達到此目的。常溫時大理石和硫酸反應十分緩慢，加熱時反應速度加快，但加快的幅度不是很大，基本上可以做到硫酸和乙醇同步減少，使硫酸的濃度保持在一個相對穩定的狀態。實際情況也確實如此，當用大理石代替碎瓷片進行反應時，(大理石的用量不能太少)，從始至終都不發生炭化，生成乙烯的氣流也很乎穩。由於原實驗中伴隨炭化還發生了其它一些副反應，隨著炭化現象的消除．這些副反應帶來的不利影響也得到了有效控制，實驗質量有明顯提高。

Ⅵ 微管反應器原理

微化工系統是以帶有微結構元件的化工裝備為核心的化工系統，它的突出特點是在微時空尺度上控制流動、傳遞和反應過程，為實現高效、安全的物質轉化提供了基礎。微化工系統相關研究起源於20世紀90年代[1]，多年來的研究結果表明:微化工設備內流動狀態高度可控，液滴和氣泡的分散尺度一般在數微米至數百微米之間;具有豐富的多相流型，一些流型中的液滴和氣泡結構與尺寸高度均一;由於微尺度下傳遞距離短、濃度/溫度梯度高以及體系巨大的比表面積，微反應器內傳熱/傳質系數較傳統化工設備大1-3個數量級[2]。
國內開展微反應器研究已經有十餘年時間，在微反應器的設計製造、微混合原理的探索、氣相反應、液相反應、納米顆粒制備等領域得到迅速發展，取得了顯著成果[3]。目前從事微反應器相關研究的主要有中國科學院大連物理化學研究所、清華大學、華東理工大學和山東豪邁化工技術有限公司等科研院校和科研單位。
聚合反應對反應器的傳熱和混合有很高的要求，傳統的釜式反應器在這方面的缺陷成為獲得高性能聚合產物的瓶頸之一。近年來，微反應器已能夠成功應用於多種機理的聚合反應並表現出對傳統釜式反應器的顯著優勢。從當前的發展趨勢來看，微反應器在聚合反應中的應用將成為化工和高分子領域的研究熱點之一。本文綜述了微反應器在不同的聚合反應體系中的應用。
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自由基聚合
聚合溫度對自由基聚合所得產物的分子量和分子量分布有很大影響。因此，對反應體系溫度的控制是控制產品質量的關鍵因素。大部分自由基聚合是較強的放熱反應，且反應速度較快。在傳統的釜式反應器中，反應器傳熱和傳質能力的不足往往導致反應體系內溫度分布不均，從而影響產物的分子量分布。在放熱較強的自由基聚合中，使用傳熱能力強的微反應器可以顯著改善反應結果。
Iwasaki等[4]用T形微混合器和內徑分別為250μm和500μm的微管式反應器組成微反應器系統(圖一)，進行了一系列丙烯酸酯單體的自由基聚合。釜式反應器中丙烯酸丁酯的聚合反應產物分子量分布指數（PDI）高達10以上，而相同的反應時間和產率下微混合器中反應產物的PDI可控制在3.5以下，證明微反應器可以有效地控制自由基聚合產物的分子量分布。

圖一 丙烯酸酯自由基聚合微反應器裝置圖
Okubo等[5]在微反應器中進行了苯乙烯的懸浮聚合，反應物和水通過K-M型微混合器形成懸浮液，再經過管式反應器進行聚合[圖2(a)]。經過降溫可直接在管內得到聚合物顆粒，通過改變流量可以調節聚合物顆粒大小。
微通道中的液滴聚合是一種新興的聚合方式，其基本原理為在管內利用不良溶劑將反應體系分隔成小液滴，每個小液滴均可看做一個微型反應器。在較小的微通道尺寸下，液滴聚合的混沌混合特性進一步強化了傳質效果。Okubo等利用液滴聚合合成了聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯，反應裝置見圖二(b)。通過調節停留時問和控制兩相間溶劑擴散的方法可以實現對聚合產物分子量的控制;與釜式反應器相比，得到的聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯的分子量分布較窄，經過微反應器沉澱得到的聚合物粒子分布也較均一。

圖二 苯乙烯自由基聚合實驗裝置示意圖
Wu等[6}在自製的雙輸入微通道(500μm*600μm)反應器中進行了甲基丙烯酸羥丙酯（HPMA）的ATRP聚合。單體和催化劑從一個通道進入，引發劑從另一入口通入，通過對流量調節可以實現對產物分子量和分子量分布的調控。Wu等[7}隨後又設計了結構相似的三輸入微反應器，實現了環氧乙烷與HPMA的ATRP共聚合。通過調節反應時間和引發劑相對濃度兩種方法均可實現對聚合產物中HPMA含量的調節。Chastek等[8]在微反應器中進行了苯乙烯和一系列丙烯酸酯的ATRP共聚合，通過特定溶劑使產物膠束化，並用動態光散射法對膠束進行了測定，反應裝置見圖三。

圖三 ATRP共聚、膠束化和DLS檢測集成裝置示意圖
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陰離子聚合
Honda等[9}在由微混合器和微管反應器(內徑250μm)組成的微反應器裝置中進行了氨基酸-N-羧基-環內酸酐的陰離子聚合。所得產物的分子量分布窄於釜式反應器的聚合產物，並可以通過調節流速來控制產物分子量和分子量分布。如圖四所示，流速降低時，反應物停留時問增長，反應程度提高，產物的分子量變大，分子量分布變窄。

圖四 不同流速下的GPC流出曲線
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陽離子聚合
Nagaki等[10]將微反應器與「陽離子池」引發技術結合，進行了一系列乙烯基醚單體的陽離子聚合(圖五)。陽離子池的高效引發結合微反應器的快速混合使反應在0.5 s內即可完成，並能很好地控制產物的分子量分布，產物的PDI從釜式反應器的2.25降至1.14。

Ⅶ 六、繪制懸浮聚合的實驗裝置簡圖並標出各部分儀器的名稱。(6分)

（1）試管（1分）  水槽（1分）  （2）③（或酒精專燈）（1分）2KMnO 4 △ K 2 MnO 4 +MnO 2 +O 2 ↑ （2分）  導管口剛有氣泡冒出就收屬集（或集氣瓶事先未裝滿水等，合理即可）（1分） 分析：根據高錳酸鉀制氧氣的裝置用到的儀器進行選擇，用排水法收集氧氣時氧氣須裝滿水，待氣泡連續均勻冒出時開始收集． （1）儀器名稱為試管；水槽 （2）用KMnO 4 製取O 2 需要加熱，且試管口要塞棉花團，因此少了酒精燈．用排水法收集氧氣時氧氣須裝滿水，待氣泡連續均勻冒出時開始收集．收集的氧氣不純可能原因有導管口剛有氣泡冒出就收集（或集氣瓶事先未裝滿水） 故答案為：（1）試管；  水槽 （2）③（或酒精燈）；2KMnO 4 △ K 2 MnO 4 +MnO 2 +O 2 ↑.導管口剛有氣泡冒出就收集（或集氣瓶事先未裝滿水等，合理即可）