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pcr擴增儀器出現污染怎麼消除

發布時間:2023-03-03 12:53:27

A. PCR實驗室污染了怎麼處理

A. 實驗室進行通風處理,至少2 周的時間;
通風可加速擴增產物的消散的速度
B. 使用清水對實驗檯面、實驗室進行清洗;
DNA不溶於酒精,使用清水多次擦拭後可消除附在實驗檯面等的核酸DNA;
C. 使用紫外燈進行房間的照射;
紫外線及產生的臭氧都有破壞DNA結構的作用
D. 之前使用的滅菌鍋使用清水清洗多次,不要和耗材等在一起滅菌;
E. 可用1mol/L 的鹽酸對可疑器具或者實驗檯面進行浸泡或擦拭。
鹽酸可使DNA脫嘌呤,破壞DNA的結構。
F. 若有條件,選擇一個新的實驗環境進行檢測實驗最好。

B. PCR實驗室污染如何預防

1.PCR實驗室嚴格分區
整個檢測過程應嚴格分區進行:PCR反應體系的配置區,標本處理、加樣區,PCR擴增、熒光檢測及結果分析區。各區使用的儀器、設備、耗材和工作服應獨立專用。
2.進行PCR操作時,工作人員應該嚴格遵守SOP操作規程
操作人員應經過專業培訓,具有一定經驗和操作技能。
3.分裝PCR試劑
當使用的 PCR 試劑盒,不是獨立分裝的反應液時,應將PCR反應液先配置好,然後分裝到反應管-20℃保存,以減少重復加樣次數,避免污染。PCR試劑、PCR反應液與樣品及PCR產物分開保存,試劑盒裡面的陽性對照、陽性參考品也應該與試劑分開放置,不應放於同一冰箱。
4.正確使用加樣器
吸樣時要特別小心,應緩慢勻速,避免液體濺到加樣器頭上。盡量一次性吸完,忌反復多次抽吸,以免交叉污染或產生氣溶膠。打出液體後拇指不應松開按鈕,將吸嘴壓掉後再將拇指松開,避免液體回吸。
5.做好實驗室的清潔消毒
操作台、移液器、離心機、PCR擴增儀等儀器設備應經常用10%次氯酸或 75%酒精、紫外線燈或臭氧消毒處理。 特別是實驗完成後,應立即清潔工作台,並進行消毒。
6.做好實驗防護
使用不含熒光物質的一次性手套、一次性專用離心管、自卸式移液器和帶濾嘴吸頭。選擇質量好的離心管,以避免樣本外溢和外來核酸的進入,打開離心管前應先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,以防止管內液體濺出,造成污染。反應管中盡量避免氣泡存在,管蓋應蓋緊。試劑准備和標本處理應使用超凈工作台或防污染罩,以防止對環境污染。

C. 怎麼防止PCR實驗室污染

PCR實驗室污染

標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由於密封不嚴溢於容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由於吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

PCR試劑的污染:主要是由於在PCR試劑配製過程中,由於加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高於PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。

實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見,因為克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由於活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。

污染監測

一個好的實驗室,要時刻注意污染的監測,考慮有無污染是什麼原因造成的污染,以便採取措施,防止和消除污染。

對照試驗

1、陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。

2、陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定後的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監測試劑是否污染。

3、重復性試驗

4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增

防止污染的方法

進行PCR操作時,操作人員應該嚴格遵守一些操作規程,最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。

劃分操作區:目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現完全閉管操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區域內進行,PCR的前處理和後處理要在不同的隔離區內進行:
1. 試劑准備區。
2.標本制備區。
3. PCR擴增區及分析區。

切記:任何一間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

分裝試劑:PCR擴增所需要的試劑均應在生物安全櫃、裝有紫外燈的超凈工作台或負壓工作台配製和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放於其中,不能用來吸取擴增後的DNA和其他來源的DNA:
1.PCR用水應為高壓的雙蒸水;
2.引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配製;
3.引物和dNTP應分裝儲存,分裝時應標明時間,以備發生污染時查找原因。

實驗操作注意事項

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意:
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套;
2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露於空氣中,避免氣溶膠的污染;
3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面;
4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精確度;
5. 最後加入反應模板,加入後蓋緊反應管;
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協助判斷擴增系統的可信性;
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區;
8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論

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