一代測序需要哪些儀器

1. 一代測序原理及步驟

一代測序儀利用Sanger測序——雙脫氧末端終止法的原理，將被熒游標記的ddNTP摻入到dNTP中，由於ddNTP隨機摻入，PCR產物從引物之後的第一個鹼基開始，每一個位置都有可能是ddNTP。由於ddNTP缺乏鏈延伸所需要的3'-OH，鏈的延伸就選擇性地在G、A、T或C處終止。這樣的PCR產物與普通PCR不一樣，不能形成一條電泳帶，而是一組長度相差一個鹼基的成百上千種片段。

2. 常用的基因測序儀器有哪些生命科學知識在什麼地方可以學習

在生物幫可以找到關於基因測序儀器的介紹，以實驗方法和實驗儀器的改進為標志DNA測序技術迄今經歷了三代的發展；常用的五種基因測序儀器ABI 3730XL、ABI SOLID 、Illumina GA、ROCH-454和HeliScope,在那裡有文檔會對儀器進行比較，介紹的比較詳細 有空可以去那兒（ YIQI.www.bio1000.com/ ）查看一下，在技術文檔中，搜一下就可以找到了。

3. 新一代測序技術

第一代測序技術以「Sanger法」為代表，實現了測序技術從無到有的飛躍，人們藉助其完成了「人類基因組草圖」，以及動植物、微生物等模式生物的基因組測序。一代測序經發展實現了自動化，但總體而言通量低、流程長、成本高，難以商業化。新測序技術以不可抵擋的勢頭發展起來。

新一代測序技術（next-generation sequencing, NGS）的起點是2005年以來Roche 454、Illumina GA/HiSeq、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS技術的發明，新技術使測序通量快速增加，測序成本極大降低。本文主要介紹Illumina測序技術、Pacific BioSciences SMRT RS測序技術、Oxford納米孔測序技術及華大平台的DNBSEQ TM 測序技術。

該技術是目前應用最廣泛的新一代基因組測序平台，它使用邊合成邊測序技術實現大規模平行測序。它最早是由Solexa公司開發，所以也稱為Solexa測序技術。Illumina測序平台有多種儀器選擇，如超大通量、適合測序中心和測序公司的 HiSeq 系列測序儀，也有適合中小型實驗室測序和醫院醫療診斷測序使用的 MiSeq 和 NextSeq500 測序儀，也有專門用於醫療診斷測序用的 MiniSeq 等。測序模式分為 高通量模式 與 快速模式 。其中，高通量模式可兼容更多的樣本量及應用種類；而快速模式測序速度更快、單次運行成本更低。

Solexa測序技術的原理網友「星空Idealist」在「知乎」、「Z_Y_H」在「」等平台做過詳細介紹：

（ 第二代測序原理的詳細解析！ - 星空Idealist的文章 - 知乎）；

（ illumina 雙端測序 - Z_Y_H的文章 - ）。

下面只做簡單概括。該方法的第一步是 建立測序文庫 （sequencing library preparation）（圖1）。基因組打碎成小片段，雙端補齊，3』加A尾，添加Illumina專用接頭（一端有oligo T），該接頭含有一個酶切位點，且為環狀非互補鏈，故形成一個「球形」接頭。當用限制酶進行切割後，形成「Y形」末端，從而能按部就班逐鏈復制。在雙鏈末端加入與後續擴增引物互補的片段（通過兩次復制實現，所加兩端引物序列不同，設為P5、P7），以及在引物內側加入標記（barcode）（所加兩端標記不同），如有需要可用 Taq 酶補齊至平末端。做好以上工作，需行純化，僅將正確添加接頭的序列用於後續反應，去除引物、酶等雜質。以上操作可一次性對整個文庫進行。

提純後進行文庫的 擴增成簇過程 （cluster generation），該過程的目的是為使測序信號放大。經變性的測序文庫在有八個泳道（lane）的晶元（flow cell）上，與固化在泳道玻片壁上的寡核苷酸特異性互補結合（P5』、P7』），經一輪復制（5』->3』），模板被切斷並洗掉，固定在晶元的寡核苷酸合成為互補鏈。然後開始橋式擴增（bridge amplification）把帶有待測DNA片段的文庫擴增到1000個拷貝左右，每個拷貝都有相同的DNA序列，這樣就形成了簇（cluster）。最後一次擴增產物變性為單鏈，這些單鏈可用來雙端測序（paired-end sequencing），但通常的做法是利用甲醯胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）的8-氧鳥嘌呤糖苷（8-oxo-G）選擇性切斷作用，選擇性將正向或反向序列從接頭處切去，避免因鏈間距過近對序列添加的影響。若先切去反向序列，則測完後，再重復前述反應至選擇性切割時，切去正向序列，進行反向測序即可。

第三步是 測序過程 。Illumina平台使用SBS技術和3』端可逆屏蔽終結子技術（3』-blocked reversible terminator）進行測序。3』端可逆屏蔽終結子技術利用有熒游標記的特殊核苷酸，這種核苷酸的3』羥基被化學基團屏蔽，導致每次DNA鏈合成都只能加入一個核苷酸，但當熒光圖像記錄完後，該化學屏蔽基團便通過酶切方法切掉，3』端恢復連接能力，如此周而復始。可以想像，由於起初變性文庫中包含模板-互補鏈（二者的標記沒有區別），在一次過程中同時被測序，因此在收集單向測序（single read sequencing）結果時需進行互補鏈識別，以免序列拼接發生混亂。正反雙端測序，極大提高了測序效率。

由於Illumina測序技術使用擴增成簇的信號放大原理，使其讀長無法達到一代測序水平，因為當擴增至數百鹼基後，受核苷酸濃度、酶活等影響，簇內鹼基添加將不再同步，不同步則信號混亂，導致讀序不準。

該技術是Pacific BioSciences推出的 單分子實時（single molecular real time）DNA測序技術 ，基於邊合成邊測序原理。該技術主要特點是讀長長，平均序列在10kb以上，最長讀長可達40kb。它以SMRT Cell為測序載體，SMRT Cell是一張厚度為100nm的金屬片，一面帶有15萬個（2014年）直徑為幾十納米的小孔，稱為 零模波導 （zero-mode waveguide, ZMW），也稱納米孔。測序時，系統將測序文庫、DNA聚合酶和帶有不同熒游標記的dDNA放置到納米孔底部進行DNA合成反應。通常一個納米孔固定一個DNA聚合酶Fenix和一條DNA模板。

該方法的特別之處在於 測序文庫不需要擴增 ，因為零模波導能極大消除噪音熒光背景，而使單分子反應釋放的熒光也能被准確記錄。此外，SMRT技術用於檢測標記的熒光基團與脫氧核苷酸的結合位置不是在鹼基上，而是在5』磷酸基團的第3個磷酸基上，這樣在dNTP於測序模板互補結合到測序引物上發生縮合反應後，熒光基團就隨焦磷酸一起被切掉了，省去酶切步驟。

2014年Oxford Nanopore公司推出了幾款基於納米孔測序技術的測序儀MinION、PromenthION、GridION。其基本原理為：在充滿了電解液的納米級小孔兩端加上一定的電壓，可以很容易地測量通過此納米孔的電流強度。納米孔的直徑只能容納一個核苷酸通過，當核苷酸通過時，納米孔被核苷酸阻斷，通過的電流強度隨之變弱。由於四種核苷酸鹼基的空間構象不同，它們在通過納米孔時，被減弱的電流強度變化程度也就有所不同。因此，只需檢測DNA通過納米孔時檢測電流強度的變化，即可實現實時測序。

該法亦無需文庫擴增，讀長長，實時，單分子，可以極大降低測序成本。

該技術起源於Complete Genomics，改進於華大。下面根據華大官網文章簡要說明該方法的原理。

按照圖2的流程，華大基因使用DNA納米球技術來擴增DNA序列，在該技術中，DNA被分割成約100鹼基對的片段。該片段的每一側與第一種接頭，即接頭1連接。連接後的DNA片段被擴增，通過將兩端的接頭結合而形成環狀連接的序列片段。該環狀DNA片段被切割以加入第二種銜接子，即接頭2，並重復擴增和環化過程。一旦將四種接頭，即接頭1,2,3和4（四種接頭的序列不同，有些是與引物互補的寡核苷酸，有些是標記物等）加入到DNA片段中，則通過滾環擴增最後的環狀DNA以產生 DNA納米球 （DNA nanoball, DNB）。滾球擴增時不切斷各拷貝，而利用某種方法使擴增後變性但又不影響延伸，得到一團多拷貝的納米球。將納米球固定在晶元上的網狀小孔內。

測序使用聯合探針錨定聚合技術（combinatorial probe-anchor ligation sequencing, cPAS）和多重置換擴增的雙末端測序法（MDA-PE）增加測序讀長，可測得100bp/150bp的雙端序列。目前為止，並沒有對聯合探針錨定聚合技術的詳細披露。 MDA-P的具體原理是：經復制延伸完成第一鏈（Forward Strand）的測序後，在具備鏈置換功能的高保真聚合酶的作用下，除去第一鏈模板同時合成第二鏈（Reverse Strand），並通過DNA分子錨，進行第二鏈的測序。

與其他二代測序相比，DNBSEQ TM 測序技術基於DNB，DNB以最初模板擴增，不同於PCR的指數增長，最重要的是 其不會使擴增過程中產生的錯誤累積 。

[1] 陳浩峰. 新一代基因組測序技術[M]. 第一版. 北京: 科學出版社, 2016.
[2] 第二代測序原理的詳細解析！ - 星空Idealist的文章 - 知乎.
[3] illumina 雙端測序 - Z_Y_H的文章 - .
[4] 華大科技-產品服務-全外顯子測序-產品介紹 .
[5] 解密人類基因組：下一代測序 -（一） - Jing Zhou的文章 - LEXOLOGY.