做蛋白wb需要什麼儀器

⑴ Western blot實驗需要准備什麼試劑和耗材

試劑：tris、Hcl、Nacl、脫脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tween 20、一抗、二抗、顯色劑及SDS PAGE需要的試劑（tris、Hcl、TEMED、SDS、過硫酸銨、丙烯醯胺、N N 甲叉雙丙烯醯胺、甘氨酸、非預染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考馬斯亮藍R250）、預染蛋白Marker
耗材：濾紙、膜、乳膠手套等
儀器：電泳儀、電轉槽、搖床、冰浴等

⑵ wb實驗步驟

wb實驗步驟如下：

WB實驗是通過聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原。

與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

wb實驗原理及流程圖如下所示：

顯影時間一般為1～2min（20～25℃），溫度過低時（低於16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束後，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液後，室溫下晾乾。

⑶ wb實驗的原理和步驟

WB實驗是通過聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原。

與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

WB 中常見的問題以及處理辦法。

一、信號強度低

信號強度低是指在正常曝光條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加曝光時間又會招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產生的主要緣由如下：

① 樣本蛋白表達量缺乏。倡議添加蛋白表達量較高的細胞系作為陽性對照，或是恰當增加上樣量以取得較高程度的信號；

② 蛋白質降解。在蛋白樣品制備期間留意蛋白酶抑止劑 PMSF 的運用，所制備的樣品盡快檢測或妥善保管；

③ 蛋白的轉膜。運用恰當孔徑的膜，同時優化轉膜時間，關於高分子量蛋白可能需求更長的轉膜時間。

④ 抗體的運用。抗體的反響種屬與實驗類型需求可以滿足實驗的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時間等問題也需求在實驗中不時優化；

⑤ 蛋白與抗體分離率低。減少洗膜次數或縮短洗膜時間，降低洗膜液中 NaCl 濃度等；

⑥ 抗原被封鎖液遮蓋。換用不同的封鎖液，優化封鎖液中蛋白質濃度並縮短封鎖時間；

⑦ 甲醇濃渡過高。會招致蛋白質與 SDS 別離，並沉澱在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉移。實驗中可恰當降低甲醇濃度或者運用乙醇、異丙醇替代。

二、非特異性條帶或條帶位置不對

WB 結果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對結果剖析會產生很大的干擾。普通來說惹起這類問題的主要要素有：

① 抗體的非特異性分離。通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產生非特異性條帶，而恰當降低抗體的濃度有助於減少雜帶。同時為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設二抗陰性對照；

② 樣品蛋白量過高。恰當降低上樣量，同時延長洗濯時間與封鎖時間可防止蛋白量過高對實驗結果的不良影響；

③ 蛋白質降解。會招致條帶位置變化並產生更多雜帶，倡議採用新穎制備的或是凍融次數較少的樣品；

④ 細胞傳代次數過多。會招致蛋白表達形式的分化，倡議運用原始或傳代少的細胞株；

⑤ 蛋白存在復合物。有的目的蛋白會和其他蛋白分離構成復合物，招致條帶位置改動，需求查閱相關文獻來肯定蛋白能否會構成穩定復合物；

⑥ 蛋白存在剪接體或多種修飾方式。局部蛋白存在剪切位點，有的剪切體具有免疫活性，在 WB 中也會被檢測出。此外有的目的蛋白會存在糖基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能會遠超理論分子量。因而需求查閱文獻或是 uniprot 來得知蛋白的剪切體大小以及修飾位點等。

三、背景過高

在局部 WB 結果中，條帶之外本應是空白的背景也會有較深的顏色，對剖析結果會產生干擾，而且結果圖不美觀，難以用於文章發表。這種問題的可能緣由有以下幾點：

① 封鎖不充沛。背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、BSA 等），優化反響濃度與封鎖時間，同時留意防止呈現抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶等問題；

② 洗膜不充沛。恰當增加洗膜次數弛緩沖液體積，進步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；

③ 抗體的運用。一抗濃渡過高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當優化一抗濃度，並設二抗陰性對照；

④ 曝光時間長。倡議在實驗中採用適宜的曝光時間。

四、條帶彌散或外形怪異

有時 WB 結果圖中條帶位置契合預期，但卻由於條帶彌散、外形怪異等要素招致無法運用，呈現這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細如下：

① 電泳時電壓、電流過高。會招致條帶遷移速率過快以及 SDS-PAGE 溫度升高，並可能使得條帶彌散、外形變形。倡議運用適宜的電泳條件並堅持低溫；

② 電極不均衡。會招致條帶偏斜，上樣時在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩沖液可防止這種狀況；

③ 上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大。上樣量過高可能會招致條帶彌散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會招致條帶不齊等問題。因而在上樣時需保證樣品量分歧且恰當，並堅持相同的、較低的鹽離子濃度。

④ 制膠問題。在配膠時一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正並吹出膠孔中的氣泡。

⑤ 電泳緩沖液寄存過久。電泳實驗中的緩沖液假如放置過久也會對結果有不良影響，因而倡議及時改換新的緩沖液。

五、膜上分布不平均的污點

有時在 WB 做出結果後，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規律的污點，對結果也會有較大的干擾。這類問題產生的主要緣由有以下幾點：

① 試劑、儀器等污染。倡議在每次實驗前後留意清算實驗儀器，同時及時改換呈現問題的試劑；

② 轉膜時有氣泡。確保在轉膜過程中將氣泡掃除潔凈；

③ 抗體孵育時與膜接觸不充沛。確保在抗體孵育過程中，液體總量足夠，同時將抗體平均配置，並在搖擺的條件下停止孵育；

④ 曝光時間。過度曝光會招致斑點更明顯，倡議採用適宜的曝光時間；

⑤ 膜枯燥。實驗中要保證有充沛的反響液，防止呈現干膜現象。

⑷ wb煮蛋白的機器叫什麼

wb煮蛋白的機器叫全自動WB定量分析儀。根據查詢相關資料顯示，破碎胃癌細胞提蛋白做WB，全自動WB定量分析儀是一種用於生物學領域的分析儀器，全自動WB定量分析儀可自動進行各種蛋白質樣品分離、免疫檢測、定性和定量分析，廣泛應用於蛋白質性質鑒定、蛋白質定量分析、蛋白質功能研究等。

⑸ western blot蛋白質處理要用到超聲波呢超聲波在裡面起到什麼作用呢有可以替代的方法嗎

超聲或渦旋都可以，超聲的作用：機械性破壞細胞；將沉降的細胞混勻，因為含有western及IP裂解液，使細胞與裂解液充分接觸。渦旋同樣的道理：混勻 。間隔時間：5分鍾

⑹ 做好westernblot需要注意各種細節，轉給需要的你！

做好Western需要注意各種細節。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開始談起。

1.收樣前3min先配製細胞裂解液（現配現用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻後置於冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自***公司）
2.棄掉舊的培養基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置於冰上，在搖床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.將動物組織（腦、肺等）取出後分裝成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份備用），取出後立即存於-80℃。（註：取完一塊組織後立即凍存於-80℃，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）
2.配製細胞裂解液（現配現用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據實際情況調整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好後置於冰上。
3.將其中一份組織剪下約90mg於有鋼珠的震盪勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置於-20℃，使用時取出，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度。
4.將勻漿加入90ul現配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。

我採用的是***公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度，和說明書protocol差別不大，稍有不同，如下：
1.稀釋BSA標准品以製作標准曲線：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第一管加30ulBSA，混勻後再取30ul至第二管，依次倍比稀釋，最後一管不加為空白（即本底值）。則8個標准品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配製：

戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板，清水沖洗干凈。卡槽對齊卡好後置於軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液。觀察幾分鍾後若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾乾。

1.配製8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯醯胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產生。加完後換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當水和膠之間出現一條水平的折線時，即已凝固。
2.待分離膠凝固後，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放於玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配製4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯醯胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿後沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固。可將剩餘的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。
3.此時，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置於4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均為神經毒性、致癌物質，使用時需小心。
2.灌膠時視線與膠面水平，注意操作，避免膠濺入眼睛中。
3.常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置於37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好，凝固後取下玻板，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中，4℃過夜保存。

1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內槽加滿已配好的1×電轉液，十幾分鍾後觀察是否漏液，若漏液重新調整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒跑完，電轉液就漏完了。
2.輕輕拔去梳子，第一孔加入5ul預染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入，注意不要將樣品加入其他孔，或加樣過快導致樣品溢出。
3.插好正負極，注意檢查正負極不能插反。調節電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h後；將電壓調至100V（分離膠），約1.5h後，maker分離明顯，在膠底部出現一條藍色的buffer條帶，此時電泳完畢。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。
注意：避免藍色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經跑出，所以在分離膠底部出現一條整齊水平的藍色條帶時，即停止電泳。
Little Trick
1.電泳時插好正負極後，從電泳槽底會有小氣泡上升，氣泡的數目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太一樣，觀察幾分鍾後還是如此，則需檢查是否加錯了電泳液，或者電泳液配製有誤。
2.一般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環境都有關，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間，並及時觀察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗，結果均一致。因此，總結出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件。
3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優化，結果可清晰顯出蛋白表達情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關鍵一步。
4.電泳快結束時即可准備轉膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉液中。建議在第一次WB後分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數（即樣品數），存好以後隨時使用。
5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，並夾住膜左上角，可最大程度減小對膜上蛋白的損害。

電泳結束後，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開玻璃板，根據maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片。一般一塊膠需切下目的蛋白和內參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉液中。

1.根據每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜，浸泡於電轉液中，可以提前准備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經甲醇活化20s後浸泡於電轉液中。
2.在電轉儀上製作「三明治」結構轉移膜，最下面放三層濾紙，然後依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據膜的總面積調整電流，電轉2h。
3.在電轉的同時，可以配製以下液體，事先根據膜的數量計算好所需體積：
以一塊膜為例，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配製15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配製15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體，溶於15mlTBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配製）。
5%牛奶(w/v)：配製15ml 5%牛奶(w/v)，稱取0.75g脫脂奶粉，溶於15ml TBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。
Little Trick
1.關於電轉膜，有些使用NC膜。我沒有嘗試過NC膜，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結果仍不理想，換用PVDF膜後有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購買Millipore的PVDF膜，一卷有些貴，但是可以夠一個實驗室用好幾年哪。最好不要在經銷商購買分裝的的PVDF膜，另一實驗室一同學想著價格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買了100cm2的膜，結果這價格虛高不說，而且膜還是假的，直到做完實驗了才發現，蛋白樣品也浪費了。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。
2.關於電轉方式，有些採用濕轉，有些採用半干轉，兩種方式均可。個人覺得半干轉方便簡捷些。

1.電轉結束後，根據maker位置和目的蛋白及內參大小剪膜。可在標有maker的一邊左上角剪一個小角，以清楚哪一條帶是1號樣品。
2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內參，室溫搖床上孵育2h。根據盒子大小，加入封閉液的量需沒過膜。

1.配製p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀釋，加入上述配製的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻，現配現用。
配製actin一抗（ 公司），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混勻，現配現用。
2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃過夜。我一般用封口膜做成小盒，置於大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗，完全浸沒，之後和PCR上樣儀一同固定在搖床上，4℃孵育過夜。

次日，回收一抗，做好標記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。

1.配製具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現配現用。
2.TBST洗完膜後，加入二抗，室溫搖床上孵育2h。

1.二抗孵育完後，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。
2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發光液A和100ul發光液B，根據膜數計算用量，提前4℃混合好發光液A和B。
3.到暗室中加混合好的發光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光膠片，可分別不同時長曝光，如15s，30s，1min，5min等，然後在顯影液和定影液中顯影，放入自來水中。出暗室後，將膠片掛起晾乾。
也可用Bio-rad凝膠成像系統照相，選擇不同的曝光時間成像。
Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間，多次重復實驗即可採用此曝光時長。我最開始也是在暗室中顯影，後來用Bio-rad凝膠成像系統照相，對比結果發現後者的結果更加清晰明顯，背景也更加干凈，之後就一直用成像儀曝光照相了。
2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。
3.膠片左上角maker一側一定要剪一小角或做其它標記，才可在顯影後明顯對應各個樣品。
4.若暗室曝光，可能內參蛋白發光液剛加上就出現很亮的條帶，這時最長曝光15s已經足夠。

若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉等步驟。
1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min。

⑺ Western blot實驗需要准備什麼試劑和耗材

1.1細胞

①將細胞培養皿置於冰上，用冰冷得PBS洗滌細胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧雲天P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

b.對於貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒後，細胞就會被裂解。（一般10*7個細胞用100ul裂解後獲得的上清蛋白濃度約為2-4mg/ml）

③用刮刀刮下貼壁細胞，轉移至EP管，14000rpm離心5分鍾

④將上清液轉移至EP管，負20℃保存

1.2組織

①將組織樣品剪成細小碎片（最好在冰上進行）

②加入裂解液

a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)

d.用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果組織樣品本身細小，可適當剪切後直接加入裂解液，通過強烈渦旋使樣品裂解充分

（每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解後獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態的不同組織有所不同）

③充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鍾，取上清

2. 蛋白定量（Thermo UF289356)

2.1稀釋白蛋白(BSA)標准液的制備

2.2 制備BCA工作液（A液：B液=50：1 密閉室溫可以保存一段時間）

總體積=（#標准孔+#未知孔）*#復孔*每個樣本的體積

測試管每管2ml;96孔板每孔200ul。

2.3 濃度測定

①將25ul標准液和樣本設置復孔加入96孔板，按照樣本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果樣本有限就加10ul比例用1：20；推薦每個待測的樣本做2-3個平行反應；根據樣品的濃度，可提前稀釋5-10倍)

②最好搖勻30秒，將96孔板在37℃孵育30min

③冷卻至室溫，酶標儀設置為562nm，在5分鍾內測試完所有的樣本。

④所有的樣本減去空白對照在562nm處的吸光度，繪制標准曲線，確定樣本的濃度

3. 蛋白電泳

3.1 變性以及還原蛋白

在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸。

3.1.1室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合。

3.1.2 100℃或沸水浴加熱10分鍾，以充分變性蛋白

3.1.3 冰上驟冷，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可

3.1.4通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近則可以停止電泳

4. SDS-PAGE凝膠電泳

4.1 膠的選擇與制備（根據目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）

4.2 配膠（碧雲天P0012AC）

洗干凈玻璃板，裝板加水驗漏後，晾乾裝到制膠架上。根據配方配膠。

（配膠順序：先配分離膠（下層膠），充分凝固後，再配濃縮膠（上層膠））

4.2.2 配製濃縮膠（上層膠）

4.2.3 組裝制膠器

①將制備好的分離膠灌入制膠板內（緩慢不要有氣泡），隨後緩慢加入適量異丙醇壓平分離膠。

②20-30分鍾分離膠凝聚完成，傾斜板，倒掉異丙醇，吸水紙吸去殘余液體，棄去上層壓膠的水或醇。

③加入配好的濃縮膠灌入制膠板內，然後插上梳子，20-30分鍾濃縮膠即可凝聚。

④緩慢取出梳子，上樣。

4.2.4 上樣及電泳

①蛋白冰上溶解，調整蛋白濃度，和等體積5×上樣緩沖液混合，即為上樣液。用純水沖洗膠板，放入電泳槽

②兩塊板之間倒入電泳液，確認無漏液

③迅速拔出梳子，用槍輕輕吹孔使碎片沖出

④依次加入蛋白marker和蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預染的marker.加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恆壓電泳，約30min,當指示劑溴酚藍進入分離膠後改用90V恆壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0.5cm處時關閉電源，取出膠板。（上樣時間盡量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）

⑤調節電泳的電壓和時間，傳統膠是上層膠80V，30min;下層膠120V 90-120min.

(為了防止蛋白條帶再凝膠上擴散，電泳後應盡快轉膜)

5. 轉膜

將蛋白凝膠中的蛋白，通過電流作用轉移到轉印膜上。由於蛋白凝膠本身易碎，蛋白條帶容易子啊凝膠中擴散，而且抗體也不易於進入凝膠中與目的蛋白結合，所以需要在轉印膜這樣的固相載體上實現後續封閉、洗滌，顯色等實驗操作。

5.1 轉膜

①將減好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上，然後用dd H2O漂洗2min,浸泡於轉移緩沖液中5min後開始後續操作

②裝配轉膜三明治結構（在轉移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產生）

黑面（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然後將三明治轉移至電泳槽中，黑面對黑面。

⑻ wb實驗的原理和步驟

WB實驗是通過聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上。

再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

(8)做蛋白wb需要什麼儀器擴展閱讀：

WB，蛋白質印跡（Western blotting）又稱免疫印跡（immunoblotting）,是採用印跡技術將蛋白質轉移到膜上，再根據抗原-抗體的特異性結合，檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。

一、蛋白樣本提取制備

1 細胞或組織裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑
3 蛋白定量
4 電泳上樣樣品的准備

二、電泳

1 PAGE 膠的制備
2 蛋白分子量 Marker
3 陽性對照
4 內參對照
5 上樣與電泳

三、轉膜與顯色（ Western Blot）

1 膠中蛋白的檢測
2 蛋白轉膜
3 膜上蛋白的檢測：麗春紅
4 膜的封閉
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 顯色

四、常見問題分析與解決方案
五、試劑及緩沖液配方

一、蛋白樣本提取制備

蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，是決定 WB 成敗的關鍵步驟之一。

蛋白提取總體原則與注意事項包括：

1) 盡可能提取完全或降低樣本復雜度使得集中於提取目的蛋白（通過採用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產品）。

2) 保證蛋白處於可以溶解狀態（通過裂解液的pH 、鹽濃度、 表面活性劑、還原劑等的選擇實現）。

3) 提取過程防止蛋白降解、聚集、沉澱、修飾等（全程保證在冰盒中低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。

4) 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或採取不同提取策略）。

5) 樣品分裝，長期於-80℃中保存，避免反復凍融。

⑼ western blot實驗都需要哪些儀器

western blot實驗都需要的基礎儀器有： 電泳儀，制膠板，電泳槽，濕轉的轉膜槽或者半干轉儀，脫色搖床，暗室，X光片，紅外燈，成像儀，一些基礎耗材和試劑等 基本上生化實驗室要做western blot還是很容易的