什麼儀器可以列印nc膜

❶ 點膜機工作原理

傳統的平台式點膜是等快速診斷試紙的專業製作儀器之一，作用是將C/T線抗體噴點到NC膜介質上，同時將標記物均勻地定量噴點到聚脂膜或玻璃纖維膜上，適合各類試紙

❷ 膠體金試紙條開發服務實驗報告——鍾鼎生物

實驗報告

摘要

將一抗（單鏈抗體）標記到 膠體金 ，將抗原固定到試紙條上，通過競爭法定性檢測待測標本中的抗原。要求：檢測靈敏度達到5μg/mL。

1 試劑和耗材

名稱公司名稱公司名稱公司

A α2b注射液20μg/mL、金標抗體：單鏈抗體、質控線包被蛋白：標簽抗體、檢測線蛋白：抗原客戶提供吸水紙、底板、玻纖（金標釋放墊）、玻纖（樣品層析墊）、硝酸纖維素膜Millipore膠體金溶液、封閉液、金復溶液南京鍾鼎生物

2 主要實驗儀器材料

儀器名稱公司儀器名稱公司

離心機：Mini-14k型杭州奧盛儀器有限公司噴點系統（劃膜儀）：HM3030型、斬切機：ZQ2002 型上海金標

3 實驗步驟

3.1 標記

取1支1.5mL離心管用超純水清洗兩遍，吸取1mL膠體金加入管中，向管中加入14μL0.2M碳酸鉀後震盪離心管使其混合均勻，加入8μg單鏈抗體，混勻後反應20min。加入200μL10%BSA封閉反應20min。在11000r/min 轉速下離心20min。棄去上清，用2mL 金復溶夜將沉澱復溶後鋪在6mm×300mm的金墊上乾燥。

3.2 點膜

將客戶提供的抗原稀釋至2mg/mL，用點膜儀噴點在NC膜上作為檢測線，將客戶提供的標簽抗體稀釋至0.6mg/mL，噴點在NC膜上作為質控線，55℃烘乾箱乾燥2h。

3.3 組裝檢測

在底板上從上到下依次粘貼吸水紙、NC膜、金墊（兩層）、樣品層析墊，用斬切機切成4mm寬的試紙條裝入卡殼中用以檢測。

3.4 金標抗體的驗證及靈敏度測試

檢測方法是用樣品稀釋液將A α2b注射液按照1:1的比例稀釋，然後取稀釋後的樣品60μL滴於試紙條加樣孔上，10min後判讀結果。

圖1 A α 2b不同濃度以及陰性對照結果

1：樣品稀釋液

2：0.5 μg/mL A α2b

3：2.5 μg/mL A α2b

圖1左1試紙條CT線都比較明顯，2號T線位置未完全抑制，3號基本完全抑制，試紙條檢測重組人干擾素α 2b的靈敏度在5μg/mL左右。

3.5 加速穩定性實驗

用以上方法製作的試紙條放入37℃環境下3天和7天後，再拿出來檢測，結果如圖2和圖3。

圖2 試紙條37℃3天檢測結果

1：2.5 μg/mL A α 2b

2：0.5 μg/mL A α 2b

3：樣品稀釋液

圖3 試紙條37℃7天檢測結果

1：樣品稀釋液

2：0.5 μg/mL A α 2b

3：2.5 μg/mL A α 2b

圖 2、3 中可以看出試紙條在 37℃下保存 7 天對檢測性能沒有太大影響。

4 結果討論分析

經過以上實驗，試紙條檢測重組人干擾素α 2b注射液的靈敏度在5μg/mL左右，試紙條在4℃密封條件下能穩定保存 6個月左右。

南京鍾鼎生物技術官網

❸ 做好westernblot需要注意各種細節，轉給需要的你！

做好Western需要注意各種細節。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開始談起。

1.收樣前3min先配製細胞裂解液（現配現用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻後置於冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自***公司）
2.棄掉舊的培養基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置於冰上，在搖床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.將動物組織（腦、肺等）取出後分裝成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份備用），取出後立即存於-80℃。（註：取完一塊組織後立即凍存於-80℃，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）
2.配製細胞裂解液（現配現用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據實際情況調整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好後置於冰上。
3.將其中一份組織剪下約90mg於有鋼珠的震盪勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置於-20℃，使用時取出，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度。
4.將勻漿加入90ul現配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。

我採用的是***公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度，和說明書protocol差別不大，稍有不同，如下：
1.稀釋BSA標准品以製作標准曲線：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第一管加30ulBSA，混勻後再取30ul至第二管，依次倍比稀釋，最後一管不加為空白（即本底值）。則8個標准品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配製：

戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板，清水沖洗干凈。卡槽對齊卡好後置於軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液。觀察幾分鍾後若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾乾。

1.配製8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯醯胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產生。加完後換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當水和膠之間出現一條水平的折線時，即已凝固。
2.待分離膠凝固後，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放於玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配製4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯醯胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿後沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固。可將剩餘的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。
3.此時，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置於4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均為神經毒性、致癌物質，使用時需小心。
2.灌膠時視線與膠面水平，注意操作，避免膠濺入眼睛中。
3.常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置於37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好，凝固後取下玻板，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中，4℃過夜保存。

1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內槽加滿已配好的1×電轉液，十幾分鍾後觀察是否漏液，若漏液重新調整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒跑完，電轉液就漏完了。
2.輕輕拔去梳子，第一孔加入5ul預染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入，注意不要將樣品加入其他孔，或加樣過快導致樣品溢出。
3.插好正負極，注意檢查正負極不能插反。調節電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h後；將電壓調至100V（分離膠），約1.5h後，maker分離明顯，在膠底部出現一條藍色的buffer條帶，此時電泳完畢。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。
注意：避免藍色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經跑出，所以在分離膠底部出現一條整齊水平的藍色條帶時，即停止電泳。
Little Trick
1.電泳時插好正負極後，從電泳槽底會有小氣泡上升，氣泡的數目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太一樣，觀察幾分鍾後還是如此，則需檢查是否加錯了電泳液，或者電泳液配製有誤。
2.一般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環境都有關，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間，並及時觀察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗，結果均一致。因此，總結出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件。
3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優化，結果可清晰顯出蛋白表達情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關鍵一步。
4.電泳快結束時即可准備轉膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉液中。建議在第一次WB後分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數（即樣品數），存好以後隨時使用。
5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，並夾住膜左上角，可最大程度減小對膜上蛋白的損害。

電泳結束後，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開玻璃板，根據maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片。一般一塊膠需切下目的蛋白和內參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉液中。

1.根據每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜，浸泡於電轉液中，可以提前准備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經甲醇活化20s後浸泡於電轉液中。
2.在電轉儀上製作「三明治」結構轉移膜，最下面放三層濾紙，然後依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據膜的總面積調整電流，電轉2h。
3.在電轉的同時，可以配製以下液體，事先根據膜的數量計算好所需體積：
以一塊膜為例，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配製15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配製15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體，溶於15mlTBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配製）。
5%牛奶(w/v)：配製15ml 5%牛奶(w/v)，稱取0.75g脫脂奶粉，溶於15ml TBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。
Little Trick
1.關於電轉膜，有些使用NC膜。我沒有嘗試過NC膜，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結果仍不理想，換用PVDF膜後有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購買Millipore的PVDF膜，一卷有些貴，但是可以夠一個實驗室用好幾年哪。最好不要在經銷商購買分裝的的PVDF膜，另一實驗室一同學想著價格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買了100cm2的膜，結果這價格虛高不說，而且膜還是假的，直到做完實驗了才發現，蛋白樣品也浪費了。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。
2.關於電轉方式，有些採用濕轉，有些採用半干轉，兩種方式均可。個人覺得半干轉方便簡捷些。

1.電轉結束後，根據maker位置和目的蛋白及內參大小剪膜。可在標有maker的一邊左上角剪一個小角，以清楚哪一條帶是1號樣品。
2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內參，室溫搖床上孵育2h。根據盒子大小，加入封閉液的量需沒過膜。

1.配製p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀釋，加入上述配製的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻，現配現用。
配製actin一抗（ 公司），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混勻，現配現用。
2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃過夜。我一般用封口膜做成小盒，置於大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗，完全浸沒，之後和PCR上樣儀一同固定在搖床上，4℃孵育過夜。

次日，回收一抗，做好標記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。

1.配製具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現配現用。
2.TBST洗完膜後，加入二抗，室溫搖床上孵育2h。

1.二抗孵育完後，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。
2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發光液A和100ul發光液B，根據膜數計算用量，提前4℃混合好發光液A和B。
3.到暗室中加混合好的發光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光膠片，可分別不同時長曝光，如15s，30s，1min，5min等，然後在顯影液和定影液中顯影，放入自來水中。出暗室後，將膠片掛起晾乾。
也可用Bio-rad凝膠成像系統照相，選擇不同的曝光時間成像。
Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間，多次重復實驗即可採用此曝光時長。我最開始也是在暗室中顯影，後來用Bio-rad凝膠成像系統照相，對比結果發現後者的結果更加清晰明顯，背景也更加干凈，之後就一直用成像儀曝光照相了。
2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。
3.膠片左上角maker一側一定要剪一小角或做其它標記，才可在顯影後明顯對應各個樣品。
4.若暗室曝光，可能內參蛋白發光液剛加上就出現很亮的條帶，這時最長曝光15s已經足夠。

若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉等步驟。
1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min。

❹ 硝酸纖維素膜NC膜的應用技巧

從本節開始，我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧。
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。
2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。
兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。
2. 膜對結合的影響
1）膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這只僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標復合物通過T線的時間也就越長，反應也就越充分。
綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
這個差異主要來源於兩點：
1> 生產膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數量不同。同理，在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。
2）緩沖液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支持， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲」魚」先學」漁」.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩沖液的構成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要添加作用物質，原來的很多需要添加的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。
作用物質的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少信號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環境
環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關系
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式，進口劃膜式優於國產劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復合物通過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分布。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要通過穩定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用後靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入調試生產。
硝酸纖維素膜NC膜
規格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保質期一年
產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆,濕時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。

❺ 如何選擇膠體金試紙製作儀器，耗材，原料

一． 製作儀器 用途：將C、T線抗體噴點到NC膜上，形成測試線條。同時將膠體金噴點到玻璃纖維墊上。 噴點儀器現在市面上使用最多的是BIODOT儀器，產地為美國BIODOT公司，國內代理商為基因有限公司。 該儀器又分為三種類型。 1． 噴膜儀器 目前型號為XYZ3050，原來老型號為XYZ3000。稱XYZ，是來源於它可以全數字控制三維運動噴點。 XYZ3000在這個行業的很多單位里都是能看到的。之所以稱為噴膜，就是因為可以使用BJQ3000這款噴頭，以不接觸膜（在膜上方）的方式將溶液噴到膜上。實際上整個線是由大量的均勻點組成的，例如1mm的線噴點溶液量是1ul，而這1ul是由10nl/個的點組成，即1mm線是由100點組成。即單位長度內噴點的抗體量是一定的，這在實際應用中，做定量產品是必須的，而用在做其他定性產品也可以很好的控制批間差。也可以用來點生物晶元和感測器。 AJQ3000是一個噴金頭，主要是用來將膠體金溶液噴到玻璃纖維的墊子上。由於膠體金溶液很黏稠，所以要使用外部動力促使其噴下，一般用氮氣瓶和空氣壓縮機。 解答一些反饋的問題。BJQ3000的電池閥容易堵的問題，這個閥為了控制精確度將孔徑做得非常小，所以絕對是不能夠用來噴金溶液，同時噴點的C、T線抗體要求噴點前使用0.45um濾器過濾或者離心1萬轉/10分鍾，以防止大顆粒堵塞管道。 目前反饋堵閥問題的一些單位我自己去看過，基本上都是沒處理造成的大顆粒堵閥，少數地方是因為環境塵埃含量太大，使管道堵了。有些人使用BJQ3000噴金溶液，剛開始是沒問題的，後期就開始出現噴點斷點等不良現象，因為已經被金顆粒堵住了，這個在戰友「免疫學小弟」那家工廠就是這樣。 2． 劃膜儀器 型號有ZX1000，這個就比上面的儀器少一個數字控制運動軸了，是接觸膜，用一個劃頭（型號：FLONTLINE1000）利用膜的毛細作用將抗體劃到膜上的。噴金與上同。 其實這個機器也可以配BJQ3000噴頭來定量噴點。很多人不知道。價格方面比上面那個便宜一些。 3． 卷狀儀器 就是連續化大規模生產儀器了，生產速度一般1卷50m長的膜，30分鍾能噴完。這個效率太高，以致很少廠家能用得上，再加上工藝方面的原因，在國內這個機器台數是個位數。 非BIODOT噴點儀器 有些地方有使用非BIODOT的國產噴點儀器，目前我看過一些都不是很好用，唯獨給我印象不錯的是一個滾軸式的傳送噴點機器。它的特點是用滾輪傳送進料，劃線噴點。效率非常高，估計是現在所有平板噴點（包擴BIODOT和其他）儀器的5倍以上，廢品率也不高，較進口價格低（製造人是我一個好朋友，告訴我的是成本價），很是實用。 切條機 用途：將做好的試紙長條分切成可以使用的單人份短條，一般切成寬度3-4mm/條。 1． KINIMATIC 毫無疑問這個品牌的切刀是這個行業裡面的NO.1。目前最長時間的我看過用了5年都沒出問題。不過現在這個牌子在國內沒有代理商，也沒有辦法保修。 2． BIODOT CM4000 這個太多了，很多單位都有。現在有些生產公司已經開始使用國產的切刀了，畢竟經濟一些。質量方面肯定是比進口差，但對公司而言，短期投入越少越好了。 3． 國產（福建產） 國內切刀有好幾個產地。但通過比較後發現，福建這個工廠生產的還是比較不錯。無論外觀還是做工，使用起來也方便。這個產品的模仿原型是BIODOT的CM4000。 4． 滾刀 滾刀由於本身設計上還存在著許多的不足，大多數都是在短期嘗試後被放棄。再說在滾刀上投入的精力太大並不劃算，廢品率總是居高不下。 貼膜機 用途：將NC膜、玻璃纖維、PVC板、濾紙等各部件粘合到一起。 這個只有BIODOT一家有。實用性一般。用手貼貼掉好了，沒必要搞個累贅的機器。 讀條機 用途：讀出反應條帶的顏色，並且做對應的數據圖像分析。 1．通用讀條機 BIODOT TSR3000 其實我個人認為這個產品很值，因為在目前的膠體金研究中，出結果是最麻煩的，每次都是以符合率來做為標准，發的文章水平檔次也不高。而這個儀器可以出一份很好的數據分析說明，包括實物照片、吸光曲線圖、某點數值、吸收峰面積、同批多樣品疊合對比。但好象現在買去的，利用率都不高，因為軟體是英文的 ：）。缺點在於只能讀可見光。 2. 專用讀條機 相對上面的儀器，專用讀條機往往是為某個產品專門設計的儀器，如早孕試紙的定量讀條機，測心梗的臨床用讀條機、測熒光產品的讀條機。 二． 耗材 NC膜 實驗開始階段最關鍵的問題就是膜的選擇。 技術參數主要涉及的是膜爬速？s/4cm、對抗原抗體的包被能力。表面活性劑在膜製造的時候就加入膜內了，是主要影響因數之一，各品牌間差異較大。 現在膜一共有三個品牌，Whatman& S&S, Millipore, Sartorius. 另外還有MDI印度膜和國產膜。每個品牌下面又有各種不同的型號。所以在選擇上對剛入行的新手來說，非常困難。 對於剛開始做研究的客戶，millipore的M135將是一個最好的選擇。這個膜性能表現中性條件，現在應用在多個產品上均性能優良，最適宜作為開始研究的平台。當然也可以嘗試其他膜。 但一進入生產，情況就需要做一些調整，從性價比的角度來看M135價格過貴，會導致生產成本高，利潤下降。此時就需要做一些調整，建立供應商篩選流程，和多供應商替換的辦法。最理想的情況是三個供應商的產品都能適用於生產，性能不發生大的變化，這是現實可行的。 建議大家採用不處理膜的工藝方式，這樣容易進行替換。經常被選擇的是S&S的AE99、whatman的8um、millipore的M135、sartorius的CN140。 規格一般是採用25mm*50m和20mm*50m兩種常用規格。 價格是一個很敏感的因數，小批量一兩卷，就沒有談價的可能和意義。中型批量一般是在100卷，大批量在500-1000，批量越大價格當然也越便宜，畢竟這是一個工業耗品。

❻ 科研人必備的實驗技能

生信需要做濕實驗嗎？有人認為不需要，有人認為需要。做一個好的研究不僅需要大量的生信分析，還需要更多的實驗驗證，生信分析和實驗結果往往是相互促進的。接下來，從生物實驗的角度跟大家分享掌握濕實驗必備的一些技能或技巧。

1.  基礎知識儲備

任何一個新的研究方向都離不開理論依據，查閱參考文獻資料並總結是一個科研人的必備技能。啟動實驗的第一步當然就是實驗模型的建立。

關於動物模型製作：在開始製作活體動物模型之前，查閱文獻，確定製作方法，包括但不限於確定實驗鼠類型、月齡、性別、給葯劑量、給葯方式、一次或多次給葯時間、動物生存活動環境，實驗鼠是否需要分籠單只飼養、給葯前是否需禁水和（或）禁食等等，如果模型製作失敗，請檢查製作模型的過程中的每一個步驟，必要時再次查閱相關資料適當調整。

以小鼠灌胃給葯為例，選用合適型號的灌胃針，抓取小鼠使其頭頸部成一條直線，方便灌胃針從口角進入。針頭進入小鼠的食管即可，不可過深，手法要輕柔，否則會戳傷小鼠食道或胃壁，灌胃容積一般不超過0.8毫升，最多不可超過1毫升。

2.  手術操作或取材

這一部分沒什麼需要特別注意的，記住兩點：准備好取材所需器材，例如手術刀、組織剪、眼科剪、鑷子、EP管、培養皿、75%酒精、麻醉劑和必備液體（例如4%PFA固定液）等；提前了解目標取材位置，要盡量快速地做固定、冷凍、離體孵育或其他處理，保證實驗樣本保存完好。

3.  明確實驗目標的特徵或特性

根據研究目標的不同水平選擇實驗類型，例如，在蛋白水平，一般選用特定染色方法顯示形態或共存情況，選用Western Blot統計蛋白量表達的升高或降低；在RNA水平，一般選用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）體現基因表達的上調或下調等；在離體狀態，可選用模擬體液環境的孵育實驗對離子通道進行干預或不做干預，探討研究目標的產生、分泌、消耗等；利用在體實驗探討生理或病理（口服給葯，腹腔注射，靜脈注射，基因敲除等）情況下研究目標的變化或調控等。如果不清楚如何選擇實驗方法，查閱文獻資料或者問前輩。

以染色為例：選擇典型的染色方法很重要。明場染色相較於免疫熒光染色保存時間較長。例如HE染色（觀察組織形態等），PAS染色（糖原染色，一般用來顯示糖元和其它多糖物質），DAB染色（免疫組化染色，需注意顯色時間），Masson染色（膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。用來顯示組織中纖維以及炎性因子的染色方法之一）等，一定要根據目標特性選擇不同染色方法。

4.  准備實驗材料

千萬不要小看實驗材料的准備，在選定實驗方法之後，檢查實驗所用到的器械和材料等是否准備完畢，確保實驗材料的齊全是保證實驗順利進行的第一步，畢竟在某些爭分奪秒的時間里現場准備實驗材料是來不及的，而且會大大影響實驗結果的准確性。

注意一些實驗常用液體（例如PBS，PBST，TBS，TBST，梯度酒精，Kerb』s液等），記得檢查配液時間和可回收利用液體的使用次數等，如果發現肉眼可見的性狀改變，如出現沉澱、絮狀物，顏色改變等，請重新配液。

以Western Blot蛋白提取為例，樣本類型不同（組織樣本、貼壁細胞樣本、懸浮細胞樣本等）選擇的裂解液也不同，要根據自己的實驗目的選擇合適的裂解液。一般使用RIPA裂解液（主要從動物組織和動物細胞中抽取可溶性蛋白）。RIPA裂解液的配方有很多種，根據其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類。關於不同的RIPA裂解液以及其它裂解液的主要特點和差異，以及如何選擇裂解液，參考如下：

另外，Western Blot蛋白轉移膜也可根據實際情況選擇。一般分為三種材質：NC膜，PDVF膜和尼龍膜，區別如下：

5.  把握實驗時間

對於一些復雜的實驗，請一定要根據實驗步驟里規定的時間進行操作，不得提前或拖延。例如，染色過程中染色或脫色時間不準確，就會導致顯色過深、過淺、深淺不一甚至不顯色。再者，Western Blot電泳（俗稱跑膠）時間一定不能提前結束或延遲結束，讓蛋白跑得太久，指定離家出走，跑的時間太短又達不到分離蛋白的目的（可以根據溴酚藍的位置判斷跑膠時間是否合適，其實跑膠時間也不是特別固定的一個數字，而是一個區間，具體與蛋白樣品、儀器電壓、或凝膠的質量有關哦~ 當然，如果配膠過程出現問題，就可能導致膠體本身不凝，或漏液後凝膠量不夠，導致配膠失敗，這個在下一部分講）；還有轉膜過程，時間不合適的話，目標蛋白就跟你的NC膜或PVDF膜無緣啦！另外，注意合理安排自己實驗的時間，注意一些總時長較久的實驗，盡量早點開始做，否則要麼餓肚子要麼熬大夜，實驗也不一定能做好，實慘。

6.  注意實驗細節

切記「細節決定成敗」。

以Western Blot膠體的配製為例，目前一般使用SDS-PAGE膠作為Western Blot的基礎,按照說明書配液即可。在配製前的准本工作中，需注意仔細檢查制膠器和玻璃板（包括長板和短板）是否完好，盡量避免玻璃板體存在較大的劃痕或有角破損，充分洗凈制膠器和玻璃板並晾乾（可以噴灑無水乙醇加快水分蒸發），後進行膠體配製。這里分享一個配膠前的小技巧：組裝好制膠器後，可以在玻璃板間隙加入一些無水乙醇，記住液面位置，計時3-5分鍾，觀察液面位置是否下移，判斷該制膠器是否有漏液情況，否則在配膠過程中出現漏液情況是比較麻煩的，要拆了重洗哦~

膠體分為分離膠和濃縮膠（也就是通常說的下層膠和上層膠），膠體凝固的標志如下：

注意：此處分離膠上的酒精或DDW（deuteriumdepleted water）為隔絕氧氣的作用（也有一部分壓膠作用），必須要加，倒出後可倒置制膠器晾乾或用濾紙從玻璃板間隙的一角吸干，要保證濾紙干凈無雜質。圖中將濾紙插入玻璃板間隙的做法個人不推薦，雖然不排除某些蛋白不受影響，但為了確保實驗順利，還是注意一些為宜。

分離膠凝固後加入濃縮膠，並立即插入梳子（對，它就叫梳子），插入梳子的過程中可以左右小幅度擺動梳子，避免濃縮膠中留有氣泡。

濃縮膠凝固時間大約在40-60分鍾，可觀察到膠體與梳子分離，拔出梳子（或觀察不到，但只要時間大概夠了也可以拔出），注意要豎直向上拔出，避免左右擺動破壞凝膠，導致前功盡棄。

另外，如果Western Blot電泳時蛋白出現跑歪或條帶相連的情況，可能的原因包括：（1）膠體均一度不好（一般是因為加入到玻璃板之前沒有充分搖勻）；（2）膠體有氣泡；（3）下層膠和上層膠的界面不平；（4）儀器的問題等。

下圖為蛋白正常的樣例，每一孔的蛋白各自待在自己的「跑道」位置，互不打擾：

但是如果發現根本沒有條帶，一定要去檢查實驗步驟是否有錯誤，去查閱文獻，有可能你的目標蛋白在你的樣本中根本不表達，或只有在特定條件下才表達。

關於蛋白樣本提取：開始實驗前問自己實驗檯面、液氮、器械准備好了嗎？實驗助手找好了嗎？請盡可能快速剪碎組織，剪得盡可能碎，這樣與裂解液充分接觸（記得稱重，根據樣本重量確定加入裂解液體積），提取出來的樣本才不會出現濃度過低的問題。樣本數量較多時盡量要有小夥伴合作，否則第一個和最後一個樣本相差時間太久，可能會導致提取效果不理想。如果只能自己提取樣本的話，盡量不要一次性提取太多數量的樣本，避免手忙腳亂哦。切記一定根據實驗步驟實施。

關於免疫熒光染色：是以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術。孵育抗體時需要避光，注意阻水圈保持閉合，避免漏液；洗完切片盡量擦去阻水圈，注意不要碰到組織切片，否則可能前功盡棄。吸取封片甘油量根據組織切片大小適當調整，放蓋玻片時注意不要留有氣泡等等。封片完成之後請立即拍片，如果時間不允許，可避光4℃暫放（最好不超過24小時，如果存放2-3天的經歷，拍出來的效果可能不盡人意），放太久熒光會逐漸淬滅的。

另外，免疫熒光染色一般可選擇染1種（下圖綠色UEA-1，DAPI染胞核不計入抗原種數）或2種抗原抗體結合物（綠色TIR和紅色MUC2，黃色視為二者共存），也可染3種及以上，但是要根據激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laserscanning microscope）是否可以顯示相應顏色來決定，一般染2種就可以了。

如果加入多於1種的抗體，那麼請注意區分兩種抗體的來源應與樣本來源各不相同（例如，小鼠的結腸組織，不能使用小鼠來源的抗體，可以使用兔來源、驢來源或其他物種來源的抗體）。

7.  要有 准備意識 做到心中有數

有些實驗試劑需要現用現配，也就是說我們不能把所有材料都准備好再做實驗，需要在實驗間隙准備一些材料。那麼作為實驗新手，可能會出現下一步所需要的東西來不及准備的情況。這就需要我們在實驗過程中有意識地去思考接下來的實驗步驟，做到心中有數，才不會出現手忙腳亂的情況。

8.  注意科學性原則

無論哪一種實驗，都應遵循實驗的科學性，不可人為改變實驗結果。當實驗結果與實驗假設不一致時，應遵循事物的客觀規律。有些結果可能由於實驗操作過程出現一些問題導致其本身就是錯誤的，應多次實驗進行驗證。當然，由於個體差異，某些實驗數據會偏低或偏高，可以排除差異較大的個體，但是不可以純粹為了驗證假設，而有傾向地選取靠近假設的數據進行統計，這是違背科學性原則的。

9.  及時書寫實驗記錄

很多時候實驗結果不好的原因往往可以從實驗記錄中找到蛛絲馬跡，但它卻是經常被忽略的。實驗記錄的書寫應該做到及時、真實、准確、完整地記錄實驗名稱、實驗目的、實驗材料（包括實驗試劑及配製方法、儀器、樣本等）、實驗過程和實驗結果、出現的問題（應分析可能原因及解決辦法）和實驗小結（簡要總結實驗結果和解釋，有助於指導後續研究）。每次實驗還應該記錄實驗參與人、實驗的日期和時間、以及實驗條件（包括溫度、濕度等）。因此一定要按時及時地書寫實驗記錄，以便在實驗過程中追溯實驗原始數據並隨時查閱。

10.  放平心態 保持樂觀

做科研不是一簇而就的事情，不要期望只做一次實驗就驗證了假設或得到滿意的結果。前期可能會出現各種各樣的問題，這是通向科研本身的必經之路，沒有捷徑可言，而且要保證實驗結果的可重復性，也必須多重復幾次，夯實實驗結論，最終的理論才更具說服力。保持一個樂觀的心態做實驗是我們一直需要修煉的技能，實驗虐我千百遍，我待實驗如初戀。當然，有些實驗是就算重復N多次也不會有什麼令人滿意的結果的，因為可能一開始的方向就是錯的。這就需要我們從知識儲備開始，立論假設就要嚴謹、認真且全面，一定是閱讀了大量參考文獻和資料之後得出的研究方向和假設，要有立題依據，可以說查閱文獻資料在整個做實驗階段是貫穿始終的。

各個實驗都有或簡單或復雜的步驟和技巧，但是核心原則和思想是相通的，以上分享的部分濕實驗中所需要注意的一些細節和技巧，希望對生信分析過程中需要學習濕實驗進行驗證的小夥伴有所幫助。

(文中，侵刪）

醫學數據分析，優選思路，盡在 生信人公眾號

❼ dot是什麼意思

dot指的是美國交通部規定的安全標准，我們不妨了解一下。下面是我給大家整理的dot是什麼意思，供大家參閱!

dot是什麼意思

“DOT”表示此輪胎符合美國交通部(U.S. Department of Transportation, DOT)規定的安全標准。“DOT”後面緊挨著的11位數字及字母則表示此輪胎的識別號碼或序列號。 DOT分為ABC三級，其中C級標准最低，僅達到了美國運輸部(DOT)規定的最低性能條件。其他兩級均高於DOT要求的標准。

dot網路游戲用語

DOT，即Damage over time，是一種施放於目標後在一段時間內持續對目標造成傷害的技能.

例如(魔獸世界)：

術士的“痛苦災禍”、牧師的“暗言術·痛”、聖騎士的“奉獻”、獵人的“毒蛇釘刺”等。

與其對應的是HOT，即Heal over time，是一種施放於目標後一段時間內持續對目標造成治療的技能.

例如(魔獸世界)：

牧師的“恢復”等。

dot剎車油

DOT最低沸點標准數據 剎車油種類

(醇基) 干沸點 DOT3 205 °C DOT4 230°C DOT5.1 ~270 °C

濕沸點 DOT3 140 °C DOT4 155°C DOT5.1 ~190 °C

測試標准註解： 1、干沸點指剛從密封容器中加入剎車系統後的沸點;

2、濕沸點是指經過2年使用後含水3.5%的沸點

建議更換剎車油的條件：

絕對標准：沸點抵於180°C就必須更換——LUCAS提供一個貨號為YWB 211的brake fluid boiling point tester剎車油沸點測試器

一般標准：一般汽車廠家的維修資料都建議2年更換 除非你進行沸點測試，否則很難說絕對的更換時機，比如將車輪沒入水中剎車分泵完全在水中浸泡，即使密閉良好的剎車系統，全新的醇基剎車油7天後含水量就會超過3%，35天後含水就高達7%! 所以汽車廠家的更換標准之外，還要看你的使用環境，如果是剎車油才用了1年碰上水淹車，我想為安全起見，都得馬上換剎車油

DOT5.1可以顯著增加更換周期，一般正常平均更換周期可以到5年左右，由於使用的MTG硼酸酯和DOT4的基本相同，因此可以兼容DOT4，(個人認為叫SUPER DOT4更合適。和DOT5完全是兩種材質，容易混淆)，目前主要用於賽車、軍用車輛上

dot擴散光學

DOT——diffuse optical tomography：擴散光學層析成像

DOT俗稱光CT，是生物醫學光子成像技術的一種，利用擴散光在組織中的相對穿透深度實現器官級(5~10cm)的臨床診斷用層析成像，提供了基於組織體重要生化成分的無創功能檢測新模式。DOT和OCT一起構成了目前新興的生物醫學光子學中最具挑戰性的研究課題和下一代醫學成像模態的研究焦點。

DOT與現有成像方法相比有如下優點：1.完全的無創檢測，安全可靠。2.數據採集速度快。3.合理的空間解析度和較高動態時間解析度。4.直接和間接地提供同時的組織體解剖和生理功能信息。5.對目標運動的穩健性、便攜性和低價格。

目前對DOT的應用研究主要集中在以下幾方面：

光學乳腺成像技術——乳腺腫瘤的早期診斷。

新生兒大腦發育過程供氧狀況及血氧動力學觀測。

腦功能成像。

光動力療法反應信息獲取。

dot(ELISA)

斑點ELISA(Dot-ELISA)是在常規ELISA方法的基礎上發展起來的，1982年Hawks等及Herbrind等以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體幾乎同時建立了Dot-ELISA檢測法，保留了常規ELISA特異、敏感、經濟、快速、可自動化等優點，而且NC膜具有更好的吸附能力(可100%吸附)，用離子型去污劑裂解的抗原也能很好地吸附，從而使該方法迅速得到推廣，被認為是傳染病及寄生蟲病診斷技術標准化最有前途的新技術之一。以硝酸纖維膜(NC膜)代替聚苯乙烯板，在膜上滴加抗原或抗體，封閉後，按常規ELISA實驗操作，最後用不溶性底物顯色，一般是二氨基鄰苯胺(DAB)，其氧化產物為不溶的棕色產物，根據顯色反應有無或顏色深淺，進行定性或半定量。斑點ELISA方法具有以下優點：特異性強，假陽性少;由於NC膜對蛋白質的吸附能力優於聚苯乙烯，故其敏感性比常規ELISA高6-8倍;試劑用量少，比常規ELISA至少節約10倍;抗原膜保存期長，-20℃可保存半年;檢測結果可長期保存;操作簡便，不需特殊儀器(酶聯檢測儀)。此法簡易快速，便於推廣，目前已廣泛用於多種寄生蟲病的診斷和監測，如弓形蟲病、包蟲病、囊蟲病、捻轉血矛線蟲病、血吸蟲病、華枝睾吸蟲病、旋毛蟲病等抗原或抗體的檢測。

ELISA：酶聯免疫吸附劑測定

❽ Western blot實驗需要准備什麼試劑和耗材

1.1細胞

①將細胞培養皿置於冰上，用冰冷得PBS洗滌細胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧雲天P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

b.對於貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒後，細胞就會被裂解。（一般10*7個細胞用100ul裂解後獲得的上清蛋白濃度約為2-4mg/ml）

③用刮刀刮下貼壁細胞，轉移至EP管，14000rpm離心5分鍾

④將上清液轉移至EP管，負20℃保存

1.2組織

①將組織樣品剪成細小碎片（最好在冰上進行）

②加入裂解液

a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)

d.用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果組織樣品本身細小，可適當剪切後直接加入裂解液，通過強烈渦旋使樣品裂解充分

（每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解後獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態的不同組織有所不同）

③充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鍾，取上清

2. 蛋白定量（Thermo UF289356)

2.1稀釋白蛋白(BSA)標准液的制備

2.2 制備BCA工作液（A液：B液=50：1 密閉室溫可以保存一段時間）

總體積=（#標准孔+#未知孔）*#復孔*每個樣本的體積

測試管每管2ml;96孔板每孔200ul。

2.3 濃度測定

①將25ul標准液和樣本設置復孔加入96孔板，按照樣本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果樣本有限就加10ul比例用1：20；推薦每個待測的樣本做2-3個平行反應；根據樣品的濃度，可提前稀釋5-10倍)

②最好搖勻30秒，將96孔板在37℃孵育30min

③冷卻至室溫，酶標儀設置為562nm，在5分鍾內測試完所有的樣本。

④所有的樣本減去空白對照在562nm處的吸光度，繪制標准曲線，確定樣本的濃度

3. 蛋白電泳

3.1 變性以及還原蛋白

在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸。

3.1.1室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合。

3.1.2 100℃或沸水浴加熱10分鍾，以充分變性蛋白

3.1.3 冰上驟冷，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可

3.1.4通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近則可以停止電泳

4. SDS-PAGE凝膠電泳

4.1 膠的選擇與制備（根據目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）

4.2 配膠（碧雲天P0012AC）

洗干凈玻璃板，裝板加水驗漏後，晾乾裝到制膠架上。根據配方配膠。

（配膠順序：先配分離膠（下層膠），充分凝固後，再配濃縮膠（上層膠））

4.2.2 配製濃縮膠（上層膠）

4.2.3 組裝制膠器

①將制備好的分離膠灌入制膠板內（緩慢不要有氣泡），隨後緩慢加入適量異丙醇壓平分離膠。

②20-30分鍾分離膠凝聚完成，傾斜板，倒掉異丙醇，吸水紙吸去殘余液體，棄去上層壓膠的水或醇。

③加入配好的濃縮膠灌入制膠板內，然後插上梳子，20-30分鍾濃縮膠即可凝聚。

④緩慢取出梳子，上樣。

4.2.4 上樣及電泳

①蛋白冰上溶解，調整蛋白濃度，和等體積5×上樣緩沖液混合，即為上樣液。用純水沖洗膠板，放入電泳槽

②兩塊板之間倒入電泳液，確認無漏液

③迅速拔出梳子，用槍輕輕吹孔使碎片沖出

④依次加入蛋白marker和蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預染的marker.加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恆壓電泳，約30min,當指示劑溴酚藍進入分離膠後改用90V恆壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0.5cm處時關閉電源，取出膠板。（上樣時間盡量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）

⑤調節電泳的電壓和時間，傳統膠是上層膠80V，30min;下層膠120V 90-120min.

(為了防止蛋白條帶再凝膠上擴散，電泳後應盡快轉膜)

5. 轉膜

將蛋白凝膠中的蛋白，通過電流作用轉移到轉印膜上。由於蛋白凝膠本身易碎，蛋白條帶容易子啊凝膠中擴散，而且抗體也不易於進入凝膠中與目的蛋白結合，所以需要在轉印膜這樣的固相載體上實現後續封閉、洗滌，顯色等實驗操作。

5.1 轉膜

①將減好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上，然後用dd H2O漂洗2min,浸泡於轉移緩沖液中5min後開始後續操作

②裝配轉膜三明治結構（在轉移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產生）

黑面（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然後將三明治轉移至電泳槽中，黑面對黑面。