用什麼儀器進行酶切

❶ 酶切的步驟

一、實驗材料准備
1. 材料：質粒DNA。
2. 試劑：限制性內切酶、ddH2O。
3 . 儀器：微量移液槍，離心機，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測儀。
二、單酶切 1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。（2）限制性內切酶：1 μL（約10 U）。（3）10×buffer：2 μL。（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。3. 37℃水浴1-3 h。4. 70℃水浴10 min中止反應。5. 電泳檢測酶切效果。
三、雙酶切 1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。（2）限制性內切酶1：1 μL（約10 U）。（3）限制性內切酶2：1 μL（約10 U）（3）10×buffer：1或2 μL。（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。3. 37℃水浴1-3 h。4. 70℃水浴10 min中止反應。5. 電泳檢測酶切效果。四、結果與分析 假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點， 且酶切徹底，紫外燈下檢測電泳結果，則單酶切應為一條帶， 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多於理論值，那麼有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環三條帶），則說明質粒完全沒有被切開。

❷ 常用的酶切有哪些方法

常用的酶切方法有單酶切、雙酶切和部分酶切等幾種。（1）單酶切法：這是用一種限制性內切核酸酶酶切DNA樣品。若DNA樣品是環狀DNA分子，完全酶切後，產生與識別序列數（n）相同的DNA片段數，並且DNA片段的兩末端相同。若DNA樣品本來就是線形DNA片段，完全酶切的結果，產生n+1個DNA片段數，其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端。

（2）雙酶切法：這是用兩種不同的限制性內切核酸酶酶切同一種DNA分子的方法。DNA分子無論是環狀DNA分子，還是線形DNA片段，酶切結果，DNA片段的兩個黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。環狀DNA分子完全酶切的結果，產生的DNA片段數是兩種限制性內切核酸酶識別序列數之和。線形DNA片段完全酶切的結果，產生的DNA片段數是兩種限制性內切核酸酶識別序列數之和加1。

（3）部分酶切：部分酶切指選用的限制性內切核酸酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全的酶切。導致部分酶切的原因有底物DNA的純度低、識別序列的甲基化、酶用量不足、反應時間不夠以及反應緩沖液和溫度不適宜等。部分酶切會影響需要的DNA片段的得率。但是從另一方面說，有時根據重組DNA的需要，還專門創造部分酶切的條件，以獲得需要的DNA片段。

圖4-2：DNA酶切電泳圖

❸ 如何給一段序列增加一個酶切位點。

你可以設計帶有酶切位點的引物，對目的基因進行PCR，就可在目的基因上引入酶切位點。
步驟：引物設計（藉助軟體）——合成引物（公司合成）——PCR。
最重要的一個儀器就是PCR儀了，具體的加什麼試劑，加多少，我想樓主應該是做分子生物學，這些應該挺清楚的了。

樓主，引物一般是用軟體設計，例如Primer.5，你根據你的目的基因兩端的特點，設計合適的引物，然後在引物上再添加酶切位點 ，例如EcoRⅠ 是應用最廣泛的限制性內切酶，酶切位點和切割位點如下： 5' G↓AATTC 3' 3' CTTAA↑G 5' ，你就可以在這兩條引物上分別添加這幾個脫氧核苷酸，這不就在引物中引入酶切位點了嗎？經過PCR後引物和目的基因連在一起，酶切位點自然也連上去了。樓主，你可以根據需要，引入不同的限制性內切酶的酶切位點。

❹ 誰做過酶切質粒的實驗啊，制感受態細胞然後轉化呢求詳細過程及注意要點！

大腸桿菌電轉化感受態細胞制備
第一天： 1. 將適合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置於LB或其他營養豐富的培養基上，在37°C下過夜培養 2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用 3. 准備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存於冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用 第二天： 4. 轉移0.2-1ml過夜培養物至裝有500ml LB（或其他營養豐富的培養基）的1-2升擋板搖瓶中 5. 37°C下劇烈振盪培養2-6小時 6. 定時監控O.D.600值（培養1小時後每半小時測定一次） 7. 當O.D.600值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置於冰上冷卻至少15分鍾（需要的話這種方式可以存放培養液數小時） 8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鍾，棄上清液（如需要，沉澱可在4°C的10%甘油中保存一兩天） 9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞於少量體積中（幾毫升），然後加水稀釋至離心管的2/3體積。 10. 照上面步驟重復離心，小心棄去上清液 11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞 12. 離心，棄上清液 13. 用20ml滅菌的、冰冷後的10%甘油重懸浮細胞
14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉澱可能會很鬆散） 15. 用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml 16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管，於-80°C保存
轉化方法:1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA ，冰上培育約5分鍾 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育約5分鍾 3. 轉移DNA/細胞混合物至冷卻後的2mm電穿孔容器（無泡）中 4. 載入P1000，准備好300μl LB 或 2xYT 5. 對電穿孔容器進行脈沖（200 歐姆, 25μFd, 2.5 千伏）（檢查時間常數，應該在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中 7. 37°C下培養細胞40分鍾至1小時以復原 8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養
大腸桿菌感受態細胞制備及轉化中的影響因素
1、 感受態細胞的概念
重組DNA分子體外構建完成後，必須導入特定的宿主（受體）細胞，使之無性繁殖並高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化。
在原核生物中，轉化是一個較普遍的現象，在細胞間轉化是否發生，一方面取決於供體菌與受體菌兩者在進化過程中的親緣關系，另一方面還與受體菌是否處於一種感受狀態有著很大的關系。
所謂的感受態，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段並實現其轉化的一種生理狀態，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環境因子的影響。cAMP可以使感受態水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進轉化的作用。細胞的感受態一般出現在對數生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態細胞和進行成功轉化的關鍵。
制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70℃保存（有效期6個月）。
2、 轉化的概念及原理
在基因克隆技術中，轉化特指將質粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內，
使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術之一。
受體細胞經過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學試劑法）處理後，使細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態細胞。進入細胞的DNA分子通過復制、表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。
大腸桿菌的轉化常用化學法（CaCl2法），該法最先是由Cohen於1972年發現的。其原理是細菌處於0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附於細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時後，球狀細胞復原並分裂增值，被轉化的細菌中，重組子中基因得到表達，在選擇性培養基平板上，可選出所需的轉化子。
Ca2+處理的感受態細胞，其轉化率一般能達到5×106~2×107轉化子/ug質粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在Ca2+的基礎上，聯合其它的二價金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，則可使轉化率提高100~1000倍。
化學法簡單、快速、穩定、重復性好，菌株適用范圍廣，感受態細菌可以在-70℃保存，因此被廣泛用於外源基因的轉化。
除化學法轉化細菌外，還有電擊轉化法，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態，依靠短暫的電擊，促使DNA進入細菌，轉化率最高能達到109~1010轉化子/ug閉環DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。
3、 感受態細胞制備及轉化中的影響因素
⑴、細胞的生長狀態和密度
最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用於制備感受態細胞的菌液。不要用已
經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意OD600值與細胞數之間的關系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉化率下降。
此外，受體細胞一般應是限制-修飾系統缺陷的突變株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。並且受體細胞還應與所轉化的載體性質相匹配。
⑵、質粒DNA的質量和濃度
用於轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態的，轉化率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。此外，重組DNA分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組DNA大都構成環狀雙螺旋分子。
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入。
⑸、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
大腸桿菌感受態細胞制備及外源DNA的轉化
實驗目的
1.了解轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。
2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的方法。
3.學習將外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞並篩選轉化體的方法。
實驗原理
轉化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術。
轉化中的受體細胞： 轉化過程所用的受體細胞一般是限制性修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。
轉化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法
感受態細胞：處理後，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態。
轉化細胞(轉化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。
本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處於為感受態，然後與 pUC18質粒共保溫，實現轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨苄青黴素的基因，因而使接受了該質粒的受體菌具有抗氨苄青黴的特性，用 Apr符號表示。將經過轉化後的全部受體細胞經過適應稀釋，在含氨苄青黴素的平板培養基上培養，只有轉化體才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨苄青黴素的能力而死亡。
影響轉化率的因素
細胞生長狀態和密度。
轉化的質粒 DNA 的質量和濃度。
試劑的質量。防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。
實驗儀器 離心設備
實驗試劑大腸桿菌DH5αLB培養基，0.1mol/LCaCl2溶液（預冷）氨苄青黴素pUC18質粒
實驗步驟
菌株活化:
1.用接種環直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養基平板表面劃線，於37℃培養16小時
2.挑取一個單菌落，轉到3－5mlLB培養基中，於37℃培養3－5小時
3.將培養液全部轉到100mlLB培養基中培養2－3小時，到OD600＝0.3－0.4感受態細胞制備:
4.將培養液轉入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min
5.4000rpm離心5min,棄上清
6.加入0.8ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉澱，冰上預冷10min
7.4000rpm離心5 min,棄上清
8.加入0.2ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉澱，即可使用。也可加入總體積15％的甘油 可－70℃長期保存
外源DNA的轉化:
9.取目的DNA加入大腸桿菌感受態細胞中，於冰上放置30min
10.於42℃水浴90S
11.冰上放置2min
12.加入800μlLB液體培養基於37培養1小時
13.將培養液均勻塗布在含Amp+的培養基平板上
14.將平板放置於37℃恆溫培養箱中培養12-14個小時，然後觀察結果
對照組
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
轉化率統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數

❺ 用什麼酶切蛋白,可以得到大分子肽段怎樣能查到酶的酶切位點、酶切過程等

如果蛋白序列已知的話,用軟體如DNASTAR之類的都能進行蛋白酶模擬.一些在線工具如peptidecut也能使用.
不過這個是針對一級結構而言的,實際溶液中蛋白是折疊的,蛋白酶切位點很多都被掩埋,所以酶切預測不是很准確.至於酶切過程,這個機制到現在也只是一種假說.

❻ 在測序前如何進行pcr產物的酶切純化，注意我想知道的是用於測序的pcr產物酶切純化，不是用於克隆的酶切。

這種方法有比較大的局限性，要求pcr產物條帶要單一，如果有雜帶的話測序結果肯定就是一堆的套峰了。
這種方法是採用蝦鹼酶（SAP，Shrimp Alkaline Phosphatase）和外切酶I的混合溶液，來消化pcr擴增體系中多餘的dNTPs和引物，以便後面的測序。一般使用的終濃度為1ul混合溶液中，含有蝦鹼酶0.6單位，外切酶I1.2個單位，這個比例也可以自己通過試驗來調整。
一般是1ulpcr產物加2ul溶液。37度孵育15分鍾，即可除去多餘的引物以及dNTPs，然後80度，15分鍾就可以使蝦鹼酶失活。
這個方法的優點是簡單、快速、省錢、不損失樣品，缺點是對樣品要求高，如果一次純化測序結果不好還要重來，費時費力。所以現在測序公司一般都是使用膠回收試劑盒來純化，這樣雖然工作量比較大，費錢，但基本可以保證一次成功，總體看來還是省時省力的。

❼ 各位好！~~ 請問基因工程的儀器設備有哪些越詳細越好，謝謝！~~

首先，為了得到所需要的基因，需要提純目的RNA，需要的東西除了試劑盒以外，需要離心機，移液器，還要紫外分光光度儀來測濃度和純度。
得到RNA後，需要反轉錄為cDNA，然後擴增，需要PCR儀。檢查PCR的結果，需要電泳和顯像儀（紫外線或者熒光）

然後是酶切，分離，PCR儀和電泳儀，離心機

轉染細菌：水浴箱，孵箱，培養盤

擴增細菌：燒瓶，搖床孵箱

保存菌種的-80°冰箱，保存質粒的-20°冰箱

轉染，培養細胞：電轉染器，或者化學法（水浴箱）。二氧化碳孵箱

❽ 提完質粒後,可以進行PCR檢測也可以進行酶切檢測在什麼時候進行的個有什麼作用

一般先跑瓊脂糖電泳檢測是否提出了高質量的質粒,然後通過PCR檢測所提的質粒是否是目的質粒.
PCR檢測指用特異引物對目的DNA進行PCR,根據產物判斷
DNA是否含有目標序列.酶切檢測則是通過對目的DNA上已知酶切位點的酶切,根據產物片斷的大小是否與預期一致判斷目標DNA是否符合要求

❾ 如何給一段序列增加一個酶切位點。

你可以設計帶有酶切位點的引物，對目的基因進行PCR，就可在目的基因上引入酶切位點。
步驟：引物設計（藉助軟體）——合成引物（公司合成）——PCR。
最重要的一個儀器就是PCR儀了，具體的加什麼試劑，加多少，我想樓主應該是做分子生物學，這些應該挺清楚的了。
樓主，引物一般是用軟體設計，例如Primer.5，你根據你的目的基因兩端的特點，設計合適的引物，然後在引物上再添加酶切位點
，例如EcoRⅠ
是應用最廣泛的限制性內切酶，酶切位點和切割位點如下：
5'
G↓AATTC
3'
3'
CTTAA↑G
5'
，你就可以在這兩條引物上分別添加這幾個脫氧核苷酸，這不就在引物中引入酶切位點了嗎？經過PCR後引物和目的基因連在一起，酶切位點自然也連上去了。樓主，你可以根據需要，引入不同的限制性內切酶的酶切位點。

❿ PCR儀是個什麼儀器

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。