pcr儀器有哪些需要注意的問題

❶ PCR儀器的使用方法

1目的 </B>保證GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀的正常使用。 2 該SOP變動程序 </B>本文件的變動，可由任一使用該文件的工作人員提出，報經室技術負責人，由季度組長會議決定。如通過則公布實行。 3 適用范圍 </B>GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀。 4 使用方法 </B>⑴依次打開電腦顯示器和電腦主機電源開關，進入Windows 2000界面。 ⑵接著打開PCR儀電源開關，預熱5分鍾。 ⑶按需要在電腦上設定一個新的運行版面和程序。 ⑷推開滑門，將樣品放入樣品槽內，關上儀器滑門。 ⑸運行程序，在反應結束後按Save鍵儲存實驗結果。 ⑹關閉PCR儀電源開關。 ⑺分析實驗結果；發放臨床報告。 5 注意事項 </B>⑴儀器應放置在水平堅固的平台上，外界電源系統電壓要匹配，並要求有良好的接地線。 ⑵環境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。 ⑶儀器應配備功率≥3000W的穩壓器。 ⑷儀器應定期清潔維護。 ⑸儀器使用時應嚴格遵守上述使用步驟。 6 維護方法 </B>6.1微軟Windows 2000操作系統的維護 </B>硬碟驅動器每月29日運行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或類似軟體。現以Norton為例： ①放入Norton Utilities光碟，運行安裝（Setup）文件。 ②安裝完後取出Norton Utilities光碟，重新啟動計算機 ③運行Norton Utilities軟體，並啟動其清理碎片/優化程序。 ④運行完成後，檢查以確信無嚴重錯誤記錄，退出Norton Utilities。 ⑤以後每次運行Norton Utilities軟體中的清理碎片/優化程序就行了。 6.2 7000 PCR擴增儀的維護 </B>1.樣品槽的清潔 樣品槽每月29日進行一次清潔，如出現樣品槽污染情況則隨時清潔。 操作方法： ①運行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達到室溫。關閉儀器，等待10分鍾。 ②從樣品槽移去樣品架。 ③在樣品槽中加入少量95％乙醇，用棉簽擦洗反應孔。 ④用干棉簽吸干乙醇。 ⑤向里推動滑門，鎖住，使樣品槽升溫到50℃，以蒸發掉多餘的乙醇。 2.熱蓋的清潔 熱蓋每月29日進行一次清潔，如有需要隨時進行。 ①運行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達到室溫。關閉儀器，等待10分鍾。 ②逆時針旋轉GeneAmp 7000光源檢測器頂部旋鈕。向後推GeneAmp 7000光源檢測器至滑軌距離的大約1/3處。 ③GeneAmp 7000光源檢測器滑軌上有缺口。從這些缺口垂直抬起GeneAmp 7000光源檢測器，小心側放於儀器頂蓋上。不要從儀器取走熱蓋。 ④用濕潤的鏡頭紙清潔加熱蓋，待干。 ⑤將GeneAmp 7000光源檢測器重新安裝回滑軌。 6.3 GeneAmp 7000光路系統的維護 </B>1.調准ROI參照條 調准ROI參照條在儀器更換鹵素燈、儀器定期校準或儀器維修後進行。不得由一般實驗人員進行該項操作。 ①推開滑門，在樣品槽中放入熒光檢測板。 ②GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ③從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟體。 ④積分時間從512ms開始，用位置調整點，調節ROI的高度與右邊線。 ⑤逐漸增加積分時間，直到可以看到至少四個塊（約4096ms）。 ⑥調整最左側位置調整點。 ⑦減少積分時間到1024ms，調整上方與底部的位置調整點。 ⑧減少積分時間以便最右側塊可見但未飽和（約512ms），調節最右側位置調整點。如有需要用右上角拖動點調整圖象的傾斜度（以左上角為中心旋轉）。 ⑨調節後的參照條寬度必須在ROI參照塊間有小空隙。 2.校正ROI光路 ROI光路校正每月29日進行一次，以便確信結果仍然是優化的。 ①推開滑門，在樣品槽中放入熒光檢測板。 ②GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ③從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟體。 ④點選Show ROI復選框。每個樣品孔周圍出現一藍色橢圓圈。 ⑤點選Show Saturation復選框。 ⑥設定積分時間為1024ms；打開鹵素燈和光閘。 ⑦點擊LIVE按鈕獲取圖象，然後在任何地方左擊停止。獲取中等程度未飽和圖象（無紅色圖象）。 ⑧從Edit菜單中選擇Calibrate ROIs每個孔都會選取合適的ROI，確定96孔都被藍色橢圓圈正確界定。 ⑨圖象太亮太暗都會出現錯誤信息，相應增加或減少積分時間，並重復上述第8步直到無錯誤信息出現。 ⑩檢查孔ROI位置，所有孔信息都應包含在96個ROI橢圓圈中。如果沒有，重復8和9步。 3.檢查樣品槽的熒光污染 檢查樣品槽的熒光污染每月29日進行一次，如有需要隨時進行。 ①開啟GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀電源。 ②從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟體。 ③從樣品槽中移去反應板。GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ④單擊New Document建立一個新的GeneAmp 7000文件 ⑤點擊instrument中的catibrate顯示ROI inspector窗口 ⑥把Exposure Time調到最大，把Capture image From調到最敏感的FiterB點,單擊Snapshot獲取圖象。 ⑦減少積分時間，改變Capture image From中的A，B，C，D單擊Snapshot 觀察96孔中背景熒光。如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光污染。 ⑧按照樣品槽的清潔程序清洗樣品槽。 4.更換鹵素燈 儀器使用大約2000小時後應更換鹵素燈。 ①關閉儀器，冷卻15分鍾。 ②將樣品板放入儀器樣品槽，關閉滑門。在儀器的頂部向上打開燈艙門。 ③擰下固定燈罩的螺絲，將燈罩向前滑移，使其從設備上取下。 ④將舊燈泡向前滑移，使其從夾狀支架上取下，並將燈泡從燈座上拔下。 ⑤把新燈泡尾部的插桿插入燈座上的插孔，使二者連接起來。 ⑥使燈的長軸與儀器前向平行（即豎直於地面），將新燈泡滑回燈位。 ⑦在燈艙門處於打開狀態下，打開儀器，確證在儀器運行時燈也能打開。 ⑧蓋上燈罩，擰緊螺絲，關上燈艙門。 ⑨若新鹵素燈不工作，GeneAmp 7000電源保險絲可能有問題。 7 校準 </B>GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀為復雜精密儀器，其校準工作需由專業工程師進行。除與儀器廠家達成協議定期校準以外，以實驗判斷儀器校準狀態也可為何時進行儀器校準提供信息。 ⑴通過對室內質控圖的分析，我們可以及時發現系統誤差的出現。經過分析排除了試劑和人員誤差後，應懷疑是否儀器出現了檢測偏差需要校準。此時進行儀器狀態效驗實驗確定是否需要進行儀器校準。 ⑵儀器狀態效驗試驗 ①使用標准化試劑作為效驗試劑。 ②在儀器處於校準狀態下，由固定人員用標准化試劑對102、103、104、106標准品進行擴增實驗。該實驗在兩個月內應進行20次。分別計算標准曲線的斜率、截距、相關性的控制限。 ③每年6月、12月由固定人員進行上述實驗，觀察標准曲線的三個參數是否處在控制范圍和102標准品是否檢出。 ④當102標准品未檢出、標准曲線的三個參數超出控制范圍或僅出現後者時，先排除實驗的人員、試劑因素，再重復實驗。如結果依然，聯系廠家立即進行儀器校準。 ⑤當僅有102標准品未檢出時，檢查實驗全過程。再次上機檢測102標准品 兩枚。仍未檢出聯系廠家進行儀器校準。 ⑥儀器經過校準後，重復該實驗。結果歸入儀器檔案。標本前處理標准操作程序 </B>1 目的 </B>保證標本處理標准化、規范化，使不規范操作因素對實驗結果造成的影響減至最小。 2 該SOP變動程序 </B>本文件的變動，可由任一使用該文件的工作人員提出，報經室負責人決定。如通過則公布實行。 3 適用待處理標本范圍 臨床基因擴增實驗室現行檢測項目。 4 標准操作程序 4.1 DNA血清類（例如HBV） </B>⑴雙手戴上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子(夾取滅菌物品專用)取出1.5ml離心管，對應標本編號，置於離心管架上。 ⑶將移液器調到50�0�8l，先吸取50�0�8lDNA提取液加入到編好號的離心管中。然後吸取50�0�8l血清，加入離心管中混勻，注意每吸取一份血清標本應更換一次槍頭。處理全部標本，然後將離心管插到水浴板上，用鑷子放入水浴鍋，沸水浴10分鍾。 ⑷水浴完成後用鑷子將水浴板取出，轉至4℃靜置8～12小時，然後10000轉 5分鍾離心，取上清液2�0�8l點樣上機。 ⑸收拾檯面至准備狀態。 4.2 RNA血清類（例如HCV） </B>⑴雙手戴上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子(夾取滅菌物品專用)取出0.5ml滅菌離心管，對應標本編號，置於離心管架上。 ⑶先用5～40�0�8l的移液器，吸取10�0�8lRNA提取液A加入到編好號的離心管中，再用40～200�0�8l的移液器吸取50�0�8l 血清加入，最後用200～1000 �0�8l移液器加入200 �0�8lRNA提取液B，在震盪器上震盪混勻，冰上放置5分鍾，然後6000轉1分鍾離心。 ⑷去上清，留沉澱。加入450�0�8l 用DEPC水配製的75%的預冷乙醇洗滌沉澱，然後6000轉1分鍾離心，去上清。相同方法再洗一次，吸幹上清，65℃10分鍾烘乾。 ⑸給烘乾的沉澱中加入18 �0�8l的反應液I，混勻，再加入2 �0�8l逆轉錄酶，充分混勻，瞬時離心（3秒），放入溫箱，37℃45分鍾逆轉錄。 ⑹逆轉錄後95℃3分鍾高溫滅活，瞬時離心（3秒），取5 �0�8l上清立即點樣上機。 ⑺收拾檯面至准備狀態。 4.3 分泌物類（例如CT） </B>⑴雙手帶上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次對應編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子（夾取滅菌物品專用）取出1.5ml離心管，對應標本編號後，置於離心管架上。 ⑶用鑷子擰下全部試管蓋並依次置於實驗檯面上，試管對應放置於試管架上。 ⑷向每隻試管中緩慢加入1ml無菌生理鹽水。 ⑸用左手取試管於旋渦振盪器上充分振盪。 ⑹將試管中的洗脫液全部轉至相應離心管。 ⑺將試管和離心管分別放回試管架和離心管盒中前一排對應位置，並用鑷子將管蓋對號蓋回，把試管架放回冰箱。 ⑻雙手換上新手套，用左手將離心管全部配平，按順序置於離心機中相應位置，以 12000轉離心5分鍾。去上清，沉澱再加1ml生理鹽水打勻，15000 rpm離心5分鍾。（如超過12管，則需分批進行）。 ⑼離心完畢後，左手取出離心管，傾倒上液，再瞬時離心，右手取移液器將管內殘液吸盡，只留下沉澱。如無明顯肉眼可見沉澱，則可在管內留下約50�0�8l液體。 ⑽依次向管中各加入50�0�8lDNA提取液，此時移液器應與管壁約成30度角，吸頭抵至沉澱上方靠管壁處，來回抽吸，將沉澱與DNA提取液混勻。 ⑾將加入DNA提取液的標本沸水浴10分鍾。 ⑿將沸水浴後的標本放置至室溫，並將其放入4℃冰箱中6～8小時保證充分裂解。 ⒀離心標本10000 轉5分鍾。 ⒁換上新手套，取上清液2�0�8l點樣上機。 ⒂收拾檯面至准備狀態。 4.4痰液類（例如TB） </B>⑴取晨痰加入4倍體積4％氫氧化鈉待其充分液化(30分鍾)，液化過程中，振盪2～3次，如痰液粘稠，可延長液化時間。 ⑵取1 ml消化液加入離心管，10000轉離心5分鍾 ⑶棄上清留沉澱，加入1ml生理鹽水洗滌，10000 轉 5分鍾離心。 ⑷重復⑶操作，留沉澱，加入50�0�8lDNA提取液，混勻。 ⑸沸水浴10分鍾，4℃放置8～12小時。 ⑹10000 轉5分鍾離心，取上清2�0�8l點樣上機。

❷ PCR操作注意細節有哪些

實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3)避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。
(5)最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管。
(6)操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
(8)重復實驗，驗證結果，慎下結論。

❸ RT-PCR實驗操作的注意事項

在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。

真核生物的基因組是DNA，為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之後，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。

所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA裡面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因並表達出相應的蛋白，只能通過提取其mRNA並RT-PCR這條頗費周折的途徑。

1．RNA的提取

RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。

1．1 分離高質量RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。

1．2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶

在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。

在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制劑

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

*異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准備的工作

*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，並定期進行除菌。

*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，並經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。

*盡量使用一次性的塑料製品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。

*關於一次性塑料製品，建議使用廠家供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數廠家供應的無菌塑料製品很少有RNase污染，買來後可直接用於RNA操作。用DEPC等處理的塑料製品，往往由於二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。

*所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。

*配製溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應採用未開封的新瓶裝試劑。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。

*配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。

1．5 RNA提取的一般步驟

RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。

沉澱RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。

洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的方式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉澱出蛋白。共純化DNA對於樣品間標准化RNA的產量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚後立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。

2．RT-PCR

RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription；RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。

2．1 RT-PCR的原理

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。

RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一隻管中順次進行。

2．2 RT-PCR的步驟

⑴在冰浴離心管裡面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；

⑵70度水浴5分鍾，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；

⑶加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然後分再裝到每一管），混勻；

⑷37度水浴5分鍾，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；

⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；

⑹70度10分鍾結束反應（此處是滅活酶活性，避免對後續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，餘下的-70度保存。

2．3 RT-PCR的引物設計

RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。

* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。

目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。

引物的穩定性依賴於儲存條件。應將乾粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大於10μM濃度溶於TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。乾粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。

2．4 引物退火溫度

引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對於設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由於在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然後再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

2．5 提高逆轉錄保溫溫度

較高的保溫溫度有助於RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對於多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然後迅速置於冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性後也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高於60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鍾。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，並加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助於防止較低溫度時所發生的分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。

2．6 促進逆轉錄的添加劑

包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定並解開RNA二級結構，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油並在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。

在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶：逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，並降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。RNaseH-的逆轉錄酶可以顯著提高長RT-PCR產物的產量，同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高於正常的37-42℃的溫度下進行。

2．7 RNaseH處理

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對於某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了或AMV合成的cDNA所產生的信號。對於多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。

2．8 小量RNA檢測方法的提高

當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助於增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨後的沉澱。對於小於50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。

2．9 一步法同兩步法RT-PCR的比較

兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優點。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易於操作，有助於減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。對於成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。

2．10 增加RT-PCR特異性

第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。

隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用於獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用於多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩定性較好，適用於較高的保溫溫度。

基因特異性引物（GSP）對於逆轉錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用於設計PCR引物的規則同樣適用於逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對於部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多於一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。

2．11 提高逆轉錄保溫溫度

為了充分利用GSP特異性的全部優點，應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那麼如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而某些特別的逆轉錄酶可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度。這有助於防止低溫時分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。

2．12 減少基因組DNA污染

RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生於基因組DNA的產物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鍾以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發生的依賴於鎂離子的RNA水解。

為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源於cDNA的PCR產物會比來源於沾染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源於基因組。

❹ pcr需要注意的問題

1、PCR產物的電泳檢測時間：一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。

2、假陰性，不出現擴增條帶

模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增。

對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。

如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

3、假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。

所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

4、出現非特異性擴增帶

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。

其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。

5、出現片狀拖帶或塗抹帶

PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

❺ PCR實驗過程中的注意事項

PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內,有些最好於當日電泳檢測,大於48h後帶型不規則甚至消失.
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件.尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究.
酶切分析：
根據PCR產物中限制性內切酶的位點,用相應的酶切、電泳分離後,獲得符合理論的片段,此法既能進行產物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究. 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據,也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法. Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針,與PCR產物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用於科研. 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析. 氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉澱 核酸.提取的核酸即可作為模板用於PCR反應.一般臨床檢測標本,可採用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用於PCR擴增.RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標准反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火並結合到靶序列上,然後快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一.因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露於空氣中,避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體於管底.若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精確度；
5. 最後加入反應模板,加入後蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器.如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論.

❻ 實時熒光定量PCR注意事項

1. 按照正確的開關機順序操作，有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮後即可打開定量PCR的收集軟體，進行實驗。關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉信號收集軟體，然後關掉定量PCR儀主機的電源，最後關閉電腦。
2. 應該定期備份您的實驗數據，備份頻率推薦每周一次，用光碟刻錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數據，這些文件所在的目錄是C：/Appliedbiosystems/SDS Document。
3. 良好的實驗室環境有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：
電源：推薦配備合適的UPS或穩壓器。
通風：儀器的通風應該沒有阻擋。
溫度：推薦實驗室配備空調，溫度應該控制在10-30°C之間。
濕度：20-80%；對於潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機。
空間：易於操作，安全。
4. 怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染
一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行ROI的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。
清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇並滴入每個污染的反應孔中。 吹打數次。 將廢液吸入廢液杯中。重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認反應孔中的殘留液體蒸發完。

❼ 在做pcr的操作過程中需注意哪些問題

首先，在設計PCR引物時，結構要好，長度應在20bp左右，避免引物間形成引物二聚體。兩條引物的退火溫度盡量保持一致，最好是在55度左右。
其次，使用的DNA模板量是比較關鍵的，應使用純度較高，基因組較完全，沒有產生斷鏈的基因組DNA。
然後是PCR體系中各個試劑的使用，比如說酶的純度，活性，並且要注意酶量一定要適中，過尤不及。各DNTP的量要保持一致。PCRbuffer中要注意有無添加鎂離子等幫助反應進行的東西。等等。
最後是PCR程序的設置。如果怕一開始就使用一個固定的退火溫度擴增不出來，可以先小批量得試驗溫度梯度，或者用touchdown程序，即先設置一個較高的退火溫度，這樣引物的特異性結合會比較好，然後每個循環的退火溫度都比上個循環低0.5度或1度，最終停留在某一個較合適的溫度完成整個程序。
PCR反應中有太多細節要注意了。只能在試驗中摸索，進步。
現在也有公司可以代做PCR，省時省力，大大縮短研究周期。
可以來杭州百替生物看看哦！

❽ PCR實驗操作注意事項有哪些

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室。

2、檢測設備必須符合標准PCR熒光實驗室設置要求

熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟體，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證。

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，並持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有「臨床基因檢測上崗證」。

5、必須在無菌無塵環境下進行操作PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標准化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果准確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行。

(8)pcr儀器有哪些需要注意的問題擴展閱讀

PCR實驗的應用價值：

能夠對患者病情進行科學、准確、實時的掌控，並結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐葯，病毒復制模板難以治療。

人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床症狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

❾ 規范化的pcr實驗室應注意哪些

1、建立樣品准備區
這個區域專門用作樣品的准備，在制備和操作用於核酸提取的試劑時應該採取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品准備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用於樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用於樣品准備間，經常清洗。
2、樣品准備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品准備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、建立前PCR區。
該去專門用於准備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品准備的污染。前PCR區必須要有試劑和准備，特別是專門用於前PCR區的正壓活塞式移液管。
4、PCR實驗室試劑的操作。
⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，並且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配製，實驗一下看試劑是否滿意，然後分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品准備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配製的試劑在用於准備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品准備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
5、在前PCR區建立PCR混合物。
⑴可以把即刻可用的「主混合物」溶液配好、分裝並保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致於配製包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配製和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明裡面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由於必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。
6、控制污染的方法。
已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。
7、後PCR區PCR完成以後，需要分析樣品並解釋數據，應該留出一個專門用於反應後處理樣品的地方。後PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用於這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用於任何前PCR活動

❿ 我想問做PCR擴增應該注意的事項

注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作。
另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉澱的部分一定要捨得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
總mRNA的提取(自己的經驗)
一、 關於Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：氯仿 (分析純)
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇並用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，並高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關於Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒後出現病變的）
針對JEV細胞總RNA的抽提法：
BHK21細胞長成單層後，接毒0.5-1ml（採用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出 現75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩 種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1） 組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震盪15s，置室溫2-3分鍾。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心後，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當於所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉澱RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉澱為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震盪，充分洗滌沉澱，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣乾燥（或真空乾燥）後，沉澱重懸於無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鍾以溶解RNA，-70℃保存備用。
（8） 抽提出的細胞總RNA乾燥後加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。於0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產物的鑒定
DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，並經常換手套。
最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭後，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的.
如何消除污染
機器運行完後，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑料手套或其他打結包好後丟入垃圾桶。
（1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNA最後加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那麼採取的方法是算出總體積後加在一個管子裡面，混合均勻之後再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。
另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系，最容易造成高濃度污染的就是產物的開蓋和質粒的稀釋。
目 前，國內外各個公司提供的診斷試劑盒大多採用了UNG來防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，來源於大腸桿菌重組克隆表達。
RNA定量
RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至於用分光光度計比較 不同標本之間就更不準了。
RNA的貯藏，最主要的是溫度，－20不夠，最好－80，液氮最保險
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度 的影響
RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利於PCR的進行
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達 量，不是絕對表達量
mRNA的分離與純化中
步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結 合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染與對策
)PCR擴增產物污染.這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，所以，擴增區的儀器什麼如槍頭等要注意。
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
1標本處理區，包括擴增摸板的制備；
2. PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；
3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染；
操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度
反應液污染
可採用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min後加熱滅活，然後加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由於UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用於檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然後烘乾，高壓滅菌，再烘乾。
2、用DEPC水洗過後當然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什麼意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許氯仿處理一下。另外，鐵製品、研砵等也可倒上酒精直接燒。