elisa儀器怎麼使用

㈠ elisa的原理和實驗步驟

摘要 ELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。操作步驟:

㈡ ELISA操作真的很簡單嗎

酶聯免疫吸附試驗(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世紀70年代發展起來的一種檢測技術，因其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優點，被廣泛應用於各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動作用。但ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個環節都會對試驗結果產生影響，出現錯誤的結果。現筆者對影響實驗結果的常見因素及相應的控制方法分析探討如下：

1試劑的因素

1.1試劑的選擇

試劑的選擇是保證血液檢測質量的關鍵要素。雖然國家採用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購知名度相對高、具有「三證」的試劑，不要用無批號的試劑，最好選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。

1.2試劑的准備

在臨床實驗室，對試劑的准備一般不太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後面時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此，在ELISA測定中試劑的准備最為關鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20-30 min後，再進行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應微孔內的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足後面的測定需求。

2樣本的因素

2.1內源性干擾因素

包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。

2.1.1類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨後加入的酶標的特異抗體IgG結合，從而出現假陽性結果。避免其發生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。②標本用聯有熱變性IgG的固相吸附劑處理。③檢測抗原時，可用2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF降解。

2.1.2補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系統的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗體分子發生變構，使Fc段的補體C1q結合點暴露出來，使C1q成為一個中介物將二者交聯起來出現假陽性結果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本。②56℃ 30 min加熱血清使C1q滅活。

2.2外源性干擾因素

包括標本溶血、標本被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。

2.2.1標本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(HRP)為標志的ELISA測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附於固相，從而與後面加入的HRP底物反應顯色。所以在采血時應注意手法，採集的血液勿用力振盪，嚴防標本溶血。

2.2.2標本的污染菌體可能含有內源性辣根過氧化物酶，可使實驗出現非特異性顯色。因此，ELISA檢測宜採集新鮮標本，如不能當時測定，5 d之內應4℃保存，1周後檢測應低溫凍存；同時，收集標本採用無菌試管，可防止標本的污染。

2.2.3標本的保存標本在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，在用間接法測定中會導致本底過深，甚至造成假陽性。 冰凍保存的標本反復凍融產生機械剪切力對標本中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結果。因此，ELISA檢測盡量採用新鮮標本，長時凍存的樣本避免反復融凍[3]。

2.2.4標本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，可使結果呈假陽性。解決的方法有：①於采血管中加入適當的抗凝劑；②將採集後的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h，待充分凝固後再離心分離血清[4]。

3操作中的因素

3.1加樣 孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結果不準確。控制方法：①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；②加酶試劑後，用吸水紙吸干孔外試劑；③作定量試驗時，使用加樣器加註試劑，並經常校正其准確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。

3.2溫育 溫育是ELISA測定最為關鍵、最容易出現問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2-8℃。目前國內售ELISA試劑盒溫育時間為37℃，30 min-1 h，進口ELISA試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較完全的結合。

3.2.1溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑後將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃需要一定時間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標本測不出來。控制方法：①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；②用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察。

3.2.2 「邊緣效應」的排除「邊緣效應」是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現象。產生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的，因此在溫育時盡量採用水浴。

3.3洗板 ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。採用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，採用半自動洗板機時，洗液量不足導致洗板不徹底，洗板針堵塞導致抽吸不完全，洗板不暢導致清洗效果差。控制方法：①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；③為了洗滌效果好，實驗室可採用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌後再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數，有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果[5]。

3.4顯色 市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應條件為37℃或室溫反應15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配製且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應盡量避免接觸金屬器械。

3.5結果判定

讀取結果要在15-30 min內完成，定性測定用肉眼判讀試驗結果時，反應板應水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時用酶標儀讀取結果，酶標儀不應置於陽光或強光照射下，需先預熱15-30 min再進行測試。

綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測定結果的因素也較多。故在實際操作的過程中，要加強質量管理，認真避免或減少影響因素，力求結果准確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據。

㈢ ELISA實驗操作中注意事項有哪些

• 1.儲存.

• 收到試劑盒後應盡快放入冷藏室內保存,保存溫度為4℃-8℃.

• 2.回溫.

• 試劑盒在使用前應於室溫（22-27℃）下充分回溫,回溫時間為40-60分鍾.回溫過程中勿將酶標板的包裝袋開封,回溫結束後再將其從包裝袋中取出使用.

• 3.樣品稀釋.

• 樣品稀釋應嚴格按照說明書要求的稀釋倍數進行稀釋.如稀釋倍數過大,可採用多步法進行樣品稀釋.例如：試劑盒要求樣品需進行500倍稀釋,可吸取5μl樣品加入245μl樣品稀釋液中,充分混勻後,再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可.

• 4.加樣.

• 稀釋好的樣品在加入酶標板進行孵育的過程中,盡可能縮短第一次加樣和最後一次加樣的時間間隔,樣品加好後馬上開始計時.

• 5.洗板.

• 樣品孵育時間結束後,馬上甩去孔內液體.如多塊酶標板需同時洗滌,可先將板內液體甩去,倒扣於吸水紙上,再依次進行洗滌.使用洗板機洗滌時,建議洗滌次數增加一次.未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月.

• 6.顯色.

• 底物葯片可在顯色前3-5分鍾加入底物緩沖液中,混合直到完全溶解.本試劑最好是現用現配,未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.

• 7.終止及讀數.

• 提前打開酶標儀,加入終止液後立即讀數.

• 8.同批號試劑盒中的試劑,除酶標二抗及陽性對照外,其餘均可通用.

• 9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對.

• 10.實驗室管理

• 桌面保持整潔,插槍頭戴手套等.

㈣ elisa原理有哪些有歸納好的么

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT為例）：
檢測原理:
本實驗採用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被於酶標板上，標本和標准品中的IL-4會 與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親 和素。生物素與親和素特異性結合；抗人IL-4抗體與結合在單抗上的人IL-4結合而形成免疫 復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標准曲線求出標本中IL-4的濃度。
試劑盒組成：
1．抗體預包被酶標板（8×12 或 8×6）
2．凍干標准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．標准品和標本稀釋液（橙蓋瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．濃縮生物素化抗體（紫蓋瓶）（1 支）
5．生物素化抗體稀釋液（藍蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．濃縮酶結合物（棕蓋瓶）（1 支）
7．酶結合物稀釋液（紫蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．濃縮洗滌液 20× （白蓋瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反應終止液（紅蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板膠紙（6/3 張）
12．產品說明書（1 份）
標本收集:
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4. 標本收集後若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存於-20℃，-70℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高於標准品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建 議做預實驗，以確定稀釋倍數)。
注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復溶後的標准品應分裝後，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鍾，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬於正常現象，微加熱至40℃使結晶完全溶解後 再配製洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應為室溫。
4. 若需要分次使用標准品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復凍 融。
5. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）。
6. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振盪器(使用最低頻率)，如無微量振盪器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
7. 在試驗中標准品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試 驗結果。
9. 試驗中請穿著試驗服並帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時， 請按國家生物試驗室安全防護條列執行。
檢測前准備工作:
1. 請提前20分鍾從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 標准品: 加入標准品/標本稀釋液0.5ml至凍干標准品中，靜置15分鍾，待其充分溶解後，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然後根據需要進行稀釋。(建議標准曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標准品原液（1000 pg/ml）若未用完請分裝後放入-20℃以下電冰箱內保存，保存兩個月。已稀釋的標准品請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）
5. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以酶結合物稀釋液稀釋濃 縮酶結合物(1:30) 成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結合物。（須提供酶結合物批號）
洗滌方法:
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15－30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒後甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和乾燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標准品和標本稀釋液，其餘相應孔中加標本或不同濃度標准品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鍾。
3．提前20分鍾准備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其餘孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鍾。
6．提前20分鍾准備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結合物稀釋液，其餘孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鍾。
9．打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鍾。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻後即刻測量OD450值(3分鍾內)。在儀器保存讀數結果並列印一份紙質結果。
13．實驗完畢後將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。
建議保存酶標板框，以備下次或者今後試驗使用。

結果判斷:
1. 每個標准品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標准曲線。以標准品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標准品的坐標點。通過標本的OD值可在標准曲線上查出其濃度。
3. 若標本OD值高於標准曲線上限，應適當稀釋後重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

靈敏度、特異性和重復性:
● 靈敏度：最小可測人IL-4達7pg/ml。
● 特異性：不與IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

IL-4簡介：
IL-4是一種由活化的T細胞產生的細胞因子，以往稱為B細胞生長因子1。在B細胞生長的早期活化B細胞，並使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B細胞進入細胞周期G1期。IL-4增強MHCII類抗原的表達和CD23（FceRII）在B細胞上的表達，誘導同種型（isotype）轉換，如促使小鼠B細胞從分泌IgM、IgG3、 IgG2b轉變成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增強單個核吞噬細胞表達MHCII類抗原，但對炎症性細胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的釋放和這些細胞的殺菌活性有抑製作用。IL-4 也活化細胞毒性 T細胞，它被認為是典型的由TH2細胞產生的細胞因子，對於T,B淋巴細胞的發育以及驅動體液免疫反應和抗體產生都是十分重要的。

㈤ 您知道ELISA試劑盒操作注意事項有哪些嗎

ELISA試劑盒操作注意事項： 1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。 2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 3．各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其准確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 4．請每次測定的同時做標准曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標准品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物請避光保存。 7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為准. 8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9．本試劑不同批號組分不得混用。 10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為准。這是在遠慕生物技術軟文裡面看到的，具體您還的查查.

㈥ ELISA 實驗注意事項知多少

• ?優質的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果准確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內醫學檢驗一般均用板式。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點（珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應用，兩者均有詳細的使用說明，須嚴格遵照規程操作）。

• 標本的採取和保存

• 通常我們可用於ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和准確性的第一步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。

• 血清

• 血清是最常用於ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。

• 用無熱原、無內毒素的試管或離心管採集血液標本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜，使血清析出。（最好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000×g離心20min，仔細收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

• 采血過程中應避免溶血，因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質，在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導致檢測的不準確性。同時也應避免細菌污染，因為菌體內可能含有內源性的HRP從而導致檢測的假陽性。

• 血漿

• 用含抗凝劑的采血管或離心管採集血液標本，標本採集後30min內4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。

• 常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

• 細胞培養上清

• 取細胞培養上清到離心管，1000×g離心20min，除去細胞碎片及雜質，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

• 細胞裂解液

• 1) 吸去培養板內的培養基，用胰酶消化細胞，加適量培養基將細胞從培養板上吹下來。懸浮細胞可省略。

• 2) 收集細胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養基，用預冷的PBS潤洗3次。

• 3) 加入適量的預冷PBS或細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

• 4) 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復凍融幾次，使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。

• 5) 4℃10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

• 組織勻漿液

• 1) 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質。

• 2) 將組織塊稱重，記錄後剪碎，碎塊應盡量小，便於勻漿得更充分。

• 3) 將組織按一定的比例加入預冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置於冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，檢測後計算樣品濃度時應乘以相應的稀釋倍數）。

• 4) 吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

• 尿液、唾液等其他液體生物樣本

• 1000×g離心20min，取上清即可檢測。

• 總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應保證所有樣本均為澄清的液體，沉澱或懸浮物都應離心去除。

• 為了保證檢測的准確性，保存於-20℃或-80℃的樣本最好在1~6個月內檢測；4℃保存的樣本應在1周內進行檢測。

• 另外，還應保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導致假陰性的結果。

• 試劑的准備

• 按試劑盒說明書的要求准備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用於洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液、洗滌液應用pH計測量。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用，一般室溫平衡不低於30min。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

• 加樣

• 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可產生氣泡。

• 加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）。有些指標檢測（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然後在微型震盪器上震盪1min。加酶結合物工作液和底物工作液時可用多道移液器，使加液過程在最短時間內完成。

• 保溫

• 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。

• ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什麼ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

• 溫育常採用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜採用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉澱。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予採用。

• 保溫的方式除有的ELISA儀器附有特製的電熱塊外，一般均採用水浴，可將ELISA板置於水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最後將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般採用鼓風恆溫箱保溫，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標准室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置於操作台上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求准確。為保證時間精確，一個人一次不宜多於兩塊板同時操作、測定。

• 洗滌

• 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

• 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下：

• （1）浸泡式：a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔後，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2min，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。

• 微量滴定板多採用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，並藉助於親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高於0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

• （2）流水沖洗式：流水沖洗法最初用於小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2min後，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2min，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用於微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳（此方法試劑盒較少採用）。

• 顯色和比色

• 顯色

• 顯色是ELISA中的最後一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助於加速顯色進行。在定量測定中，加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求准確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

• OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30min後即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止後，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

• TMB受光照的影響不大，可在室溫中置於操作台上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後，約40min顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時後即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

• 比色

• 比色前應先用潔凈的吸水紙拭乾板底附著的液體，但應盡量避免刮花表面，然後將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置於標准96孔的座架中，才可進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。

• 比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然後進行計算。

• 比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫於A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

• 酶標比色儀

• 酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用於測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特製的適用於板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的准確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.0 01，准確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對於空氣的真實A值應為1.083± 0.01(1.073~1.093），重復測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小於可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中製作標准曲線時應予注意。

• 酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30min，測讀結果更穩定（也有一些酶標儀說明書上明確標明不需要預熱）。

• 測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先後測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W 2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

• 各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細新聞記者說明書。

• 結果判斷

• 定性測定

• 定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋後進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

• 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深於陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深於陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述於下。

• （1）間接法和夾心法

• 這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近於無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應後常可出現呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結果時，更宜用顯色深於陰性對照作為標本陽性的指標。

• 目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然後進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。

• a．陽性判定值

• 陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數，以此作為判斷結果陽性或陰性的標准。

• 用此法判斷結果要求實驗條件十分恆定，試劑的制備必須標准化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規格，須配用精密的儀器，並嚴格按規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值後，先計算陰性對照A值的平均數（NC X ）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（P-N）必須大於一個特定的數值（例0.400），試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX，並≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

• 陽性判定值=NCX+0.05

• 標本A值＞陽性判定值的為陽性，小於陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數，只適合於該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

• 根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生"試驗無效"的後果。

• b.標本/陰性對照比值

• 在實驗條件（包括試劑）較難保證恆定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值後，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標准，現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應後產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規，如N<0.05<>（或其他數值），則按0.05計算，否則將出現假陽性結果。

• （2）競爭法

• 在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深於陽性孔。陰性呈色的強度取決於反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應最為敏感。

• 競爭法ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。

• a. 陽性判定值法

• 與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照A值，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值後，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（N-P）必須大於一個特定的數值（例如0.300）,試驗才有效。3個陰性對照A值均應小於2.000，而且應≥0.5×NCX並≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

• 陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

• 標本A值≤陽性判定值的反應為陽性，A＞陽性判定值的反應為陰性。

• b. 抑制率法

• 抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑製程度，按下式計算：

• 抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×100%/陰性對照A值

• 一般規定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。

• 定量測定

• ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標准品在相同的條件下製作標准曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標准曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨於平坦，中間較呈直線的部分是最理想的檢測區域。

• 測定小分子量物質常用競爭法，其標准曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標准曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。

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㈦ elisa都有什麼類型，分別適用與檢測哪些物質

夾心法

夾心法常用於檢測大分子抗原，一般之操作步驟為:

將具有專一性之抗體固著（coating）於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體

加入待測檢體，檢體中若含有待測之抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

洗去多餘待測檢體，加入另一種對抗原專一之一次抗體，與待測抗原進行鍵結

洗去多餘未鍵結一次抗體，加入帶有酵素之二次抗體，與一次抗體鍵結

洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

間接法

間接法常用於檢測抗體，一般之操作步驟為：

將已知之抗原固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘之抗原。

加入待測檢體，檢體中若含有待測之一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。

洗去多餘待測檢體，加入帶有酵素之二次抗體，與待測之一次抗體鍵結。

洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用於檢測小分子抗原，其操作步驟為：

將具有專一性之抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體

加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由於塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來。

洗去檢體與帶有酵素之抗原，加入酵素受質使酵素呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酵素的抗原越少，顯色也就越淺。

當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著於孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

㈧ 如何正確進行ELISA操作

臨床ELISA測定現通常為採用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑准備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現分述如下。 一.臨床標本的收集和保存 用於ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療葯物等。對用於激素和治療葯物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內採取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從卧位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療葯物的檢測，應根據葯代動力學選擇服葯後的最適時間抽血檢測。用於傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面： （1）要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附於固相，從而與後面加入的HRP底物反應顯色。 （2）樣本的採集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。 （3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。 （4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振盪，反復顛倒混勻即可。 （5）標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉澱後取上清檢測。 二、試劑准備 在臨床實驗室，對試劑准備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後面溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的准備最為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鍾以上後，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在後面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配製。 三、加血清樣本及反應試劑 在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的准確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。 四、溫育 溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。 溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鍾～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較完全的結合，低於1小時，可能會影響測定下限。因此，關於溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點： （1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑後，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那麼一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內質控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱後37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱後需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。 （2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鍾。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間最為完全。如2～8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由於分子運動的加憐惜，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。 （3）「邊緣效應」的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有「邊緣效應」，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種「邊緣效應」的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特徵的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置於37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除「邊緣效應」，並且可提高測定的重復性。 總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可採用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量採用水浴，溫育中讓微孔板浮於水面上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放於溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。 五、洗板 固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合於固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對於ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，藉助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附於聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由於抗體或抗原的包被通常也是通過在鹼性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附於固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高於0.2%，可使包被於固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。 在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應溫育後，將反應液吸出或甩干，然後在板孔中加滿洗液，放置2～3分鍾後，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復上述洗滌步驟3～4次，最後在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板後不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數要少於殘留量大的洗板機。在特定臨床實驗室所使用的洗板機，到底洗中國次能達到要求，可進行下面這個簡單的實驗：選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每2×8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結合物並完成溫育後，洗板孔時按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次後，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性/陰性值保持最大不變，則可以認定該實驗室所用洗板機3次洗板即可達到要求。 六、顯色 在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配製。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30分鍾。從理論上說，37℃30分鍾才可以使HRP的底物催化反應完全，盡管在最初的10分鍾內，絕大部份催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30分鍾後，終止反應比色測定。 此外，在加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴於清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好後應為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關於TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考前面有關章節內容。顯色反應完成後，加入酸終止反應，振盪混勻後即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。 七、比色 ELISA的比色測定由酶標儀進行，有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那麼此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結果。如使用酶標儀比色測定後，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。至於如何正確理解和使用酶標儀詳見後面有關章節。此處，只是強調下面兩點： （1）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。由於有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，後者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。 （2）單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最後酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點，一般不必設空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數的現象。由於ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 八、結果判定 臨床ELISA測定按其表示測定結果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出「有」或「無」的結論，分別用「陽性」和「陰性」來表示。可見定性測定通常是用於傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測定則是對標本中待測抗原的中國進行量值測定，以具體數值表示。定量測定基本上是用於非病原體抗原物質的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子葯物等。目前國內在臨床上應用的ELISA試劑盒絕大部份是用於傳染性病原體的抗原或抗體的定性測定，也有少部份用於αFP、hCG、細胞因子等的定量測定。ELISA定性測定的「陽性」和「陽性」的判定依據是試劑盒所確定的陽性判定值（Cut-off）。定量測定的「量值」依據是試劑盒中所帶標准品同時測定得出的劑量反應曲線（又稱標准曲線）。有關ELISA定性和定量測定結果的數據處理後面將有專門章節討論。本處只想強調的一點是，ELISA定性測定的「陰性」和「陽性」結果的判定依據只能是試劑盒本身所確定的Cut-off值，而不能以衛生部臨床檢驗中心供應弱陽性定值質控血清。為什麼要強調這一點呢？主要是因為以前有很多基層實驗室均使用部中心供應的弱陽性定值質控血清（以前也稱「臨界值」血清）的測定吸光度來判定結果，高於其判為陽性，反之為陰性，而不管試劑盒Cut-off值為何。到目前為止，仍有一些實驗室在堅持這種錯誤的做法。試劑盒的Cut-off值的設立是建立在一系列科學試驗及統計學研究的基礎上的（詳見後述），而部中心供應的弱陽性定值質控血清主要是供臨床實驗室進行室內質控時使用。 下面再解釋一下在ELISA定性測定結果判定中常用的一些縮寫。 （1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑製法外，其它ELISA定性測定模式中，當S/CO值大於或等於1時，標本的測定為陽性，小於1時為陰性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽性判定標准，現仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。 九、結果報告及解釋 臨床ELISA測定結果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定則報出具體的數值。結果解釋比較起來要復雜的多，它要求實驗室技術人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎。例如，對乙肝「兩對半」結果的解釋，不但要求檢驗者要知道不同的結果模式的臨床意義，而且必須對乙肝病毒的分子生物學、分子的變異及其對表型的影響有更深層次的了解。現在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫學學科，即檢驗醫學，這就要求從事醫學檢驗工作的檢驗醫師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。 綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結於下表。 臨床ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因 問 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因） 1．弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配製緩沖液的蒸餾水有問題 2．測定的重復性差 （相同樣本兩次測定結果不一致） 這是典型的由測定操作引起的問題，包括 （1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致； （2）加樣過快，孔間發生污染； （3）加錯樣本； （4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區； （5）不同批號試劑盒中組分混用； （6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致； （7）孔內污染雜物； （8）酶標儀濾光片不正確； （9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性反應等。 3．白板 （陽性對照不顯色） （1）漏加酶結合物； （2）洗板液配製中出現問題，如量筒不幹凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。 （3）漏加顯色劑A或B； （4）終止劑當顯色劑使用。 4．全部板孔均有顯色 （1）洗板不幹凈； （2）顯色液變質； （3）加底物的吸光受酶污染； （4）洗板液受酶等污染

㈨ ELISA試劑盒都可以通過什麼儀器使用

1、ELISA試劑盒都可以通過酶標儀使用。

2、酶標儀即酶聯免疫檢測儀是酶聯免疫吸附試驗的專用儀器又稱微孔板檢測器。可簡單地分為半自動和全自動2大類，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一個比色計,即用比色法來進行分析。 測定一般要求測試液的最終體積在250μL以下，用一般光電比色計無法完成測試，因此對酶標儀中的光電比色計有特殊要求。

㈩ 酶聯免疫吸附測定實驗（ELISA）的操作流程，謝謝大家

Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT為例）：
檢測原理:
本實驗採用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被於酶標板上，標本和標准品中的IL-4會 與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親 和素。生物素與親和素特異性結合；抗人IL-4抗體與結合在單抗上的人IL-4結合而形成免疫 復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標准曲線求出標本中IL-4的濃度。
試劑盒組成：
1．抗體預包被酶標板（8×12 或 8×6）
2．凍干標准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．標准品和標本稀釋液（橙蓋瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．濃縮生物素化抗體（紫蓋瓶）（1 支）
5．生物素化抗體稀釋液（藍蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．濃縮酶結合物（棕蓋瓶）（1 支）
7．酶結合物稀釋液（紫蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．濃縮洗滌液 20× （白蓋瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反應終止液（紅蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板膠紙（6/3 張）
12．產品說明書（1 份）
標本收集:
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4. 標本收集後若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存於-20℃，-70℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高於標准品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建 議做預實驗，以確定稀釋倍數)。
注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復溶後的標准品應分裝後，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鍾，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬於正常現象，微加熱至40℃使結晶完全溶解後 再配製洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應為室溫。
4. 若需要分次使用標准品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復凍 融。
5. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）。
6. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振盪器(使用最低頻率)，如無微量振盪器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
7. 在試驗中標准品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試 驗結果。
9. 試驗中請穿著試驗服並帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時， 請按國家生物試驗室安全防護條列執行。
檢測前准備工作:
1. 請提前20分鍾從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 標准品: 加入標准品/標本稀釋液0.5ml至凍干標准品中，靜置15分鍾，待其充分溶解後，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然後根據需要進行稀釋。(建議標准曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標准品原液（1000 pg/ml）若未用完請分裝後放入-20℃以下電冰箱內保存，保存兩個月。已稀釋的標准品請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）
5. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以酶結合物稀釋液稀釋濃 縮酶結合物(1:30) 成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結合物。（須提供酶結合物批號）
洗滌方法:
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15－30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒後甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和乾燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標准品和標本稀釋液，其餘相應孔中加標本或不同濃度標准品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鍾。
3．提前20分鍾准備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其餘孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鍾。
6．提前20分鍾准備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結合物稀釋液，其餘孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鍾。
9．打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鍾。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻後即刻測量OD450值(3分鍾內)。在儀器保存讀數結果並列印一份紙質結果。
13．實驗完畢後將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。
建議保存酶標板框，以備下次或者今後試驗使用。

結果判斷:
1. 每個標准品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標准曲線。以標准品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標准品的坐標點。通過標本的OD值可在標准曲線上查出其濃度。
3. 若標本OD值高於標准曲線上限，應適當稀釋後重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

靈敏度、特異性和重復性:
● 靈敏度：最小可測人IL-4達7pg/ml。
● 特異性：不與IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。