病毒的外形是用什麼儀器確定的

㈠ 1. 病毒的尺寸只有100納米左右,你知道用什麼儀器可以測量其尺寸嗎其基本測量

1. 病毒的尺寸只有100納米左右,你知道用什麼儀器可以測量其尺寸嗎?其基本測量1. 病毒的尺寸只有100納米左右,你知道用什麼儀器可以測量其尺寸嗎?其基本測量1. 病毒的尺寸只有100納米左右,你知道用什麼儀器可以測量其尺寸嗎?其基本測量

㈡ 病毒是什麼樣子的

人們在電鏡下觀察到許多病毒粒體的形態和大小，病毒的形態同其殼體的基本結構有著緊密的聯系。病毒的形態主要有以下幾種：①球狀病毒；②桿狀病毒；③磚形病毒；④冠狀病毒；⑤有包膜的球狀病毒；⑥具有球狀頭部的病毒；⑦封於包涵體內的昆蟲病毒。

病毒粒的對稱體制：病毒粒的對稱體制只有2種，即螺旋對稱（代表：煙草花葉病毒）和二十面體對稱(等軸對稱，代表：腺病毒）。一些結構較復雜的病毒，實質上是上述2種對稱相結合的結果，故稱作復合對稱（代表：T偶數噬菌體）。

病毒主要由核酸和蛋白質外殼組成。由於病毒是一類非細胞生物體，故單個病毒個體不能稱作「單細胞」，這樣就產生了病毒粒或病毒體病毒粒，有時也稱病毒顆粒或病毒粒子，專指成熟的結構完整的和有感染性的單個病毒。核酸位於它的中心，稱為核心或基因組；蛋白質包圍在核心周圍，形成了衣殼。衣殼是病毒粒的主要支架結構和抗原成分，有保護核酸等作用。衣殼是由許多在電鏡下可辨別的形態學亞單位——衣殼粒所構成。核心和衣殼合稱核心殼。有些較復雜的病毒（一般為動物病毒，如流感病毒），其核心殼外還被一層含蛋白質或糖蛋白的類脂雙層膜覆蓋著，這層膜稱為包膜。包膜中的類脂來自宿主細胞膜。有的包膜上還長有刺突等附屬物。包膜的有無及其性質與該病毒的宿主專一性和侵入等功能有關。昆蟲病毒中有一類多角體病毒，其核殼被蛋白晶體所包被，形成多角形包涵體。

病毒的復制過程叫做復制周期。其大致可分為連續的5個階段：吸附、侵入、增殖、成熟（裝配）、裂解（釋放）。

㈢ 觀察病毒的形態結構通常要使用的儀器是（）A．放大鏡B．低倍光學微鏡C．電子顯微鏡D．高倍光學顯微

病毒是一類形體十分微小的生物，形體比細胞小得多，只能用納米來表示．大約10億個細菌等於一顆小米粒大，大約3萬個病毒等於一個細菌大，一個病毒的大小約為10～300納米，（1納米=一百萬分之一毫米），普通光學顯微鏡是觀察不到病毒的，電子顯微鏡放大倍數比光學顯微鏡高許多，可以達到幾十萬倍．所以只有藉助於電子顯微鏡才能看清楚它的形態，形態多種多樣，大體有球形、桿形、蝌蚪形；病毒沒有細胞結構，身體由蛋白質外殼和內部的遺傳物質組成．
故選：C

㈣ 證實病原體是病毒後，要用到何種儀器才能看到其真面目而便於分類/

病毒分離後，電子顯微鏡觀察！

㈤ 我們觀察病毒，應選用的儀器是（）A．放大鏡B．光學顯微鏡C．電子顯微鏡D．解剖顯微

病毒是一類比細菌還要小的微生物，形體及其微小，放大鏡和光學顯微鏡放大倍數太小，不能觀察到病毒而解剖顯微鏡能形成正立像，立體感強．常常用在一些固體樣本的表面觀察，或是解剖、鍾表製作和小電路板檢查等工作上，也不能觀察到病毒，通常只能藉助於電子顯微鏡才能觀察到它們．
故選C

㈥ 植物病毒檢測的血清學技術都有哪些

植物病毒的外殼是一種核蛋白，在蛋白的表面帶有抗原決定簇，當植物病毒進入動物體內時，即可產生與抗原相應的抗體，這種帶有抗體的血清即為抗血清。相應的抗原抗體之間可產生專化性的結合，即抗體只能與其相應的抗原結合並產生一定的反應，此即血清反應。這種反應在植物體外也能進行，根據這種反應可以測定兩種病毒間的關系。因而，血清學檢測成為植物病毒的重要鑒定技術。常見的血清反應主要有以下幾種：

中和反應：使含有植物病毒的汁液與相應抗血清中的抗體充分結合，當抗體過量時，可將所有植物病毒抗原全部吸收掉，此時因植物病毒汁液中已沒有病毒粒子存在而失去侵染性。此即為中和反應，不僅可對植物病毒進行定性，還可用於定量測定。

沉澱反應：將一系列稀釋度的抗原（病毒）和一系列稀釋的抗體（抗血清）分別混合，在兩者稀釋比例適宜范圍內可出現沉澱物，此即為沉澱反應。此類反應如：微量沉澱反應，瓊脂雙擴散反應，及免疫電泳等，都是在植物病毒檢驗中最常見的血清學技術。

凝集反應：把病毒的抗體先吸於一種與免疫無關的顆粒表面，然後使其與相應的抗原結合而出現的凝集，即為凝集反應。常用於吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、血細胞、A蛋白等。

抗體標記：對抗體用熒光素、酶或同位素等進行標記，然後通過對標記物的檢測追蹤抗原，常用的有酶聯免疫吸附、熒光免疫、同位素免疫實驗等，這類檢測技術靈敏度極高，適於對微量抗原的檢測。

現將在植物檢疫中常用的幾種血清學技術介紹於下。

1.微量沉澱反應

在溶有抗原的溶液內按適當比例加入抗血清時，抗原與抗體互相結合而沉澱。其方法如下：

（1）用蠟筆在培養皿底部各劃8條橫豎線形成方格。

（2）取兩排小試驗管，每排7～8個，一排用於抗原，一排用於抗血清，每試管中加0.2ml的緩沖液。

（3）制備1mg/ml純化病毒原液，在抗原稀釋排中加0.2ml原液於第一試管，用1ml的移液管再從中吸0.2ml移至第二管，然後再移0.2ml於第三管，一直移到最後一管，各管的稀釋度分別為原液的1/2至1/128。

（4）在小試管中加1.5ml含0.025%防腐劑NaN3的緩沖液，在緩沖液內混入0.1ml未稀釋的抗血清，制備出1/16稀釋度的抗血清作為原液；在第二排的第一試管中加0.2ml的原液，混合後移0.2ml至第二管，如此一直到最後一管，制備出1/32～1/2048的稀釋系列的抗血清。

（5）用微量移液管從抗血清最高稀釋度（1/2048）開始，在培養皿的第七橫排的每個方格滴加1滴，同樣將1/1024稀釋度的抗血清加到第六橫排，這樣將板上所有的方格均滴加各種稀釋度的抗血清。

（6）用另一移液管從最稀的抗原液開始，在第七縱排每方格內滴加1滴，按同樣方法在第一至第七縱排各方格內滴加各種稀釋度的抗原。在所有第八橫排和縱排的方格內滴一滴緩沖液做對照。隨後在反應液滴上復蓋一層液體石蠟油防止蒸發。

（7）將制備好的培養皿在室溫濕潤環境下孵育2h後，在暗室用雙目解剖鏡觀察，然後在普通冰箱內過夜，第二天繼續觀察結果，此時沉澱已清晰可見。

以最濃的沉澱為四，以下逐漸減弱的梯度分別記為三、二、一，以三為抗原最大稀釋度和產生沉澱的最小血清用量，作為抗原抗體最適比例

微量沉澱技術測定抗原抗體最適反應濃度表

（8）實際測定時，用最適稀釋度的抗血清與其相應的抗原和異種抗原進行反應，或用最適稀釋度的抗原與其相應的抗血清和異種抗血清進行反應，均可觀察它們間的血清學關系。如表0-4-2所示，

微量沉澱技術測定多種抗原間血清學關系表

各供試抗原的稀釋度為1.56mg/ml，與1/4至1/1024的不同稀釋度的抗血清反應結果表明，第一、二、五、六、七橫排的抗原與抗血清的相應抗原是相同的，第三、四兩排抗原與抗血清的相應抗原雖然不同，但有一定親緣關系，第八、十排抗原則與抗血清的相應抗原有遠緣關系或無血清學關系，第九排的抗原則完全無關。

2.瓊脂雙擴散試驗

瓊脂凝膠的含水量極高，允許分子質量20萬u以下的大分子物質自由通過，絕大多數的抗原和抗體分子質量都在20萬u以下，在瓊脂凝膠中的運動所受阻力甚小，可自由擴散，免疫雙擴散就是應用這一原理，在一塊瓊脂凝膠板上打幾個小孔，分別置入抗原及其相應抗體，抗原與抗體分別向凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度最適比例處，形成肉眼可見的抗原抗體結合物的沉澱帶，帶的大小形狀數量和密度決定於所測試的抗原抗體的特性。本法適於檢測植物粗汁液、澄清液和高度純化的抗原。試驗時需設置健康植物汁液及標准抗原作為陰性和陽性對照。本法的特點是可同時檢測一種抗原對多種抗體，或一種抗體對多種抗原間的血清學關系，對病毒的鑒別極為方便。缺點是靈敏度較低，抗血清用量大，檢測時間長。具體檢測技術如下：

（1）稱取瓊脂加入適當的緩沖液中，用水浴或微波爐加熱至瓊脂溶解，按0.1%加疊氮化鈉。置培養皿或玻璃平板於水平檯面，當瓊脂冷卻至60℃時，倒適當量於板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。靜置至凝固。

（2）將模式圖置於板下，用打孔器打孔，挑除孔中瓊脂，孔的排列有多種形式，常用的排列，由一個中央孔和周圍六個孔組成，孔的直徑7mm，周圍孔與中央孔的距離為3～4mm。

（3）用緩沖液或生理食鹽水在小試管中稀釋抗原，在周圍孔中加最適稀釋度的抗原，在中央孔中加最適稀釋度的抗血清。外圍孔中加倍比稀釋系列的抗原，中央孔加倍比稀釋系列的抗血清，產生緻密狹窄的沉澱線的組合為最適濃度。

（4）將培養皿在保濕環境下進行孵育，次日在暗背景下觀察沉澱線出現情況。在印有排列模式團的紙上，圖記沉澱線的形式，沉澱線圖形可用照相或染色保留。

（5）結果的判斷：根據沉澱線的形狀分析抗原與抗體，及抗原互相間的關系。

對長形病毒進行瓊脂雙擴散檢測時，可在瓊凝膠介質中加入十二烷基磺酸鈉（SDS），此劑為一種陽離子表面活性劑，可將病毒裂解成具有抗原活性的可擴散的片斷利於檢測。

3.對流免疫電泳

在以瓊脂凝膠為介質的情況下，免疫球蛋白帶有微弱負電荷不能抵消電滲作用，故在電泳時向負極遷移，而一般抗原蛋白帶有較強的負電荷，抵消電滲後仍向正極遷移。依此設計的對流免疫電泳是將瓊脂電泳與免疫沉澱相結合的方法，將抗原病毒放在瓊脂凝膠靠近陰極一側，抗體放在靠近陽極一側，在直流電場中，抗原遷向正極，免疫球蛋白遷向負極，相遇後形成免疫沉澱線。具體技術如下：

（1）凝膠床的制備。取定量瓊脂粉用蒸餾水浸泡2～3d，每日換水1～2次，用硼酸緩沖液配成1%～1.2%的瓊脂液，加0.1%疊氮化鈉。將玻璃放在水平台上用吸管將緩沖液瓊脂注到板面，製成2mm厚的凝膠床並打孔。

（2）將制好的凝膠床放在電泳槽內，加緩沖液（用配製瓊脂凝膠的緩沖液稀釋1倍）離床面2～4cm，在瓊脂板陰極一端孔中加入抗原，在靠陽極一端孔中加入特異性抗血清，在瓊脂床的兩端用兩層紗布使瓊脂板與電泳槽中的緩沖液相連，進行電泳。

（3）進行電泳時，電壓、電流和時間，根據緩沖液離子強度、電泳床大小和抗原性質而有所不同。只要不使病毒抗原變性，盡量保持較高的電壓，如電流超過2mA，電泳應在低溫下進行。

（4）電泳完畢後，將電泳板放在黑色背景處觀察，也可將電泳完畢的瓊脂凝膠板先浸在生理食鹽水中30min，然後放在苦味酸溶液中20min，可將背景染成黃色，沉澱為白色，便於觀察。

免疫電泳與瓊脂雙擴散相比有三個優點，快速、靈敏並可用於在瓊脂中擴散慢的長形病毒。

4.乳膠凝集試驗及A蛋白乳膠凝集試驗

用特異性抗血清提純的免疫球蛋白，將其吸附在乳膠粒子上，制備抗體免疫球蛋白致敏乳膠。當與相應的抗原相遇時即可產生凝集反應。這是一種靈敏度高特異性強的血清學技術，但是每次都要特異性抗血清提取抗體γ球蛋白，制備手續繁雜不便應用，如直接用抗血清致敏乳膠則顯著影響效果。其後Querfurth（1979）發現A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影響與相應抗原結合。這樣就可先使A蛋白與乳膠粒子結合，再與抗血清中的免疫球蛋白結合，形成A蛋白-乳膠-免疫球蛋白的復合體。這種乳膠凝集試驗可簡化致敏免疫球蛋白的過程，而獲得同樣效果。具體做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳膠的制備。

將特異抗血清用33%飽和硫酸鹽析法提取球蛋白，懸浮於0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）緩沖液內，取10%空白乳膠稀釋15倍後與等量適宜濃度的球蛋白液混合，置室溫2h後移入冰箱內過夜。經低速離心（7000r/min，20min）取沉澱懸浮於緩沖液內，經反復離心洗滌2次後將最後沉澱物懸浮於緩沖液內即可得抗體球蛋白的致敏乳膠。

（2）A蛋白乳膠致敏抗體的制備。

將市售A蛋白溶於0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸緩沖液內，製成A蛋白溶液，與等量稀釋15倍的空白乳膠液混合，置室溫3h，移入冰箱過夜。低速離心（7000r/min20min）後將沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液，反復離心洗滌2次，沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液制備A蛋白乳膠溶液，與等量適宜稀釋度的抗血清混合，置室溫下3h後移入冰箱過夜。再反復離心洗滌2次，最後將沉澱懸浮於與抗血清等等量的甘氨酸緩沖液內，即可得A蛋白乳膠致敏抗體。

（3）檢測法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀釋抗原，製成20、40、80、160、320、640、1280的系列濃度，在一潔凈玻璃板上，用筆畫好方格，每格加2滴不同稀釋度的抗原，然後再加1滴乳膠致敏抗體（或A蛋白乳膠致敏抗體）用微量血液振盪器以120r/min振盪混合後，用肉眼或10～25倍解剖鏡觀察結果。同時設空白乳膠液和健汁液對照。

陽性反應表現有明顯的絮狀或顆粒狀凝集物，背景清明透亮，陰性反應則仍為均勻的牛乳狀液。也可用濁度計檢測其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干擾較小，適於直接采自病株的澄清液，不但適合球狀病毒，對桿菌狀病毒，棒狀病毒，線狀病毒也適用，並有較高的靈敏度。但對效價低的抗血清或含有乳狀膠體的植物不適用。

5.酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗是一種固相吸附和免疫酶技術相結合的方法，將抗原或抗體包被在固相支持物上，使免疫反應在固體表面進行，並藉助標記在抗體上的酶與底物所產生的顏色，檢測相應的抗原。此法靈敏度高，特異性強，快速簡便極適宜植物檢疫應用。常用的檢測方法有以下幾種：

（1）直接法。

將待測樣品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板內，保溫後洗滌，使附著於壁上的抗原與加入的酶標抗體γ球蛋白反應，洗滌後保留與抗原結合的酶標γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度計進行檢測。

（2）間接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗體與酶結合制備酶標記抗體，將待檢抗原包被於固相載體，經過孵育洗滌，加入特異性兔抗血清，孵育洗滌後加羊抗兔酶標記抗體，孵育洗滌後加入底物，觀察結果。

（3）雙抗體夾心法。

先將特異抗體免疫球蛋白包被於固相載體，保溫洗滌後，加待測抗原，使與吸附於載體上的抗體反應，保溫洗滌後再加入特異抗體的酶標記物，最後加底物觀察反應結果。

（4）A蛋白酶聯法。

將A蛋白用pH9.6的甘氨酸緩沖液稀釋後包被微板，加入特異性抗血清，使其與已固定在微板上的A蛋白結合，再加入待測抗原使其與特異性抗體反應，再加入特異性抗體，使其與抗原反應，再加酶標記A蛋白，最後加酶的底物測其光密度值。

（5）異種動物雙抗體夾心法。

先將第一抗體（兔血清抗體）包被微量反應板，加待測抗原後，加適宜濃度的第二抗體（鼠腹水抗體），再加入市售羊抗鼠酶標記物，最後加底物觀察反應，一般8h即可得出結果。此法保持了雙抗體夾心法快速准確靈敏度高的特點，對球狀病毒、桿狀病毒、線狀病毒、棒狀病毒均可應用。抗體不必純化可直接使用（但未純化的抗血清需先選擇其最適工作濃度），使用市售酶標記物，可省去制備酶標記抗體的復雜手續，還可克服間接法非特異性反應干擾大的弱點。

（6）生物素抗生物素酶聯法。

生物素具有很強的親和力，是抗原抗體反應的1萬倍，兩者一旦結合就難以離解，且不受酸鹼變性劑蛋白溶解酶及有機溶劑的影響，具有高度穩定性，生物素一經活化可與蛋白質呈偶聯結合，即一個大分子可結合多個生物素分子，生物素又可大量結合在酶標記物上，使酶標記物成為多價，而抗生物素本身又是一個多價分子，每一亞基均可結合一個生物素分子，因此，這種方法可產生多級放大，使靈敏度提高10倍以上，並降低非特異性反應，把酶聯免疫吸附技術又提高一步。具體方法如下：

先將第一特異抗體（兔抗體或鼠腹水抗體）包被在固相載體，加待檢抗原，加第二特異性抗體（鼠腹水抗體或兔抗體），再加入相應生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶結合物，最後加入底物觀察O.D.值。

（7）膜上斑點酶聯法。

先用軟鉛筆在一張適宜大小的硝酸纖維素膜上劃好邊長1cm的方格網，把纖維素膜浸入TBS緩沖液漂洗30min，然後將膜放在兩張濾紙之間，在室溫下風干，用移液器將抗原抽提液滴在各方格中央，室溫下風干，用TBS-T緩沖液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出後放在濾紙上至膜表面水滴消失，然後浸入封閉液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保溫1h，取出晾乾後，浸在用封閉液稀釋的第一抗體溶液，在37℃下保溫1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min換液一次。將膜浸入稀釋度1/200的酶聯球蛋白，室溫保溫1h，用上法洗膜後，用鹼性磷酸酯酶緩沖液沖洗兩次，每次10min，將膜浸入酶底物溶液內，室溫下避光5～15min，顯色完全後棄去底物液，用終止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜於濾紙內徹底風干後觀察結果。

此法可克服塑料板的不足，只用目測就可對結果定性，不需要復雜的儀器，所需抗原抗體量均很少，靈敏度比常規酶聯法高10倍以上，適合大量抗原的檢測。

6.免疫電鏡

電鏡檢測可快速確定病毒粒子的形狀，是鑒定病毒不可缺少的技術，但有的樣品濃度很低，用普通的電鏡技術不易觀察，如將病毒粒子包被後，抗體可把病毒粒子捕捉成聚集物便於觀察。同時還可從病毒粒子與抗體的結合情況，觀察兩者間的血清學關系。通常使用的有以下幾種方法：

（1）葉片浸沾血清技術。

把一滴稀釋的抗血清，滴在有膜的銅網上，將葉片的新鮮切口浸入血清滴中1～2s，置於室溫下5～10min，使血清與相應的病毒聚集並裝飾起來，再進行負染檢鏡。

（2）Derrick氏法。

把火棉膠膜銅網在24℃下，置於按1∶10比例稀釋於Tris緩沖液的抗血清內，然後將銅網用緩沖液沖洗後使用。把病毒的粗提液稀釋於含HCl的Tris緩沖液內，將已用血清包被的銅網浮於0.1ml的病毒稀釋液內1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水沖洗，然後乾燥噴鍍。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸緩沖液稀釋到1/100的濃度，取10μl滴於載玻片，將切成2mm見方的病葉在血清滴中壓碎，在濕室中保濕15min，用鑷子持有膜銅網蘸取液滴，用20倍磷酸緩沖液沖洗後，再用蒸餾水洗，最後用5滴醋酸氧鈾染色觀察。

（4）修飾法。

取2mm見方的病葉在載玻片上的10μl蒸餾水中壓碎，持有膜銅網沾此液滴，將病毒粒子吸附於銅網上，然後將銅網用20滴的磷酸緩沖液沖洗，吸去水分後加1滴稀釋成1/100的抗血清，在濕室中保濕15min後，將銅網用20滴磷酸緩沖液和30滴蒸餾水沖洗，最後用醋酸氧鈾染色檢鏡。

（5）誘捕修飾法。

先將銅網用稀釋1/10或1/100的特異性抗血清包被，再把病毒樣品滴於銅網，保濕15min，用緩沖液及蒸餾水沖洗吸干，再加1滴稀釋成1/100的特異性抗血清，孵育15min後，用緩沖液和蒸餾水沖洗，吸干染色檢鏡。

（6）羊抗兔血清誘捕修飾法。

在誘捕修飾法未染色以前，再加1滴稀釋1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗滌後染色鏡檢。此法因病毒粒子外殼包被有兩層血清，明顯加粗，在2000倍的低倍電鏡下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白誘捕修飾法。

在福爾馬膜的銅網上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育後洗去多餘的A蛋白，再包被稀釋100倍的特異性抗血清，滴加抗原，再滴加特異性抗血清，最後染色鏡檢。此法比一般誘捕修飾法靈敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

㈦ 觀察病毒的形態結構通常要使用的儀器是什麼

C.電子顯微鏡
病毒很小，屬於亞顯微結構，用光學顯微鏡觀察不到

㈧ 科學家在觀察流感病毒時使用的是什麼顯微鏡

觀察病毒一般需要藉助電子顯微鏡，通常是透射電鏡。
流感病毒電鏡照片：www.sn.xinhuanet.com/...66.htm
另外，用X衍射技術也可以觀察病毒形態。

㈨ 如何利用電鏡技術測定病毒粒體的特徵

隨著科學的發展，電鏡已成為一種綜合的分析儀器，在植物病毒的診斷和鑒定中發揮著重要作用。植物病毒學上用得較多的是透射電鏡。

1 透射電鏡的成像原理

顯微鏡的解析度與其使用光源的波長呈負相關，即波長越短分辨本領越大。可見光的波長范圍為0.4～0.7μm，它決定了光鏡的分辨極限為0.2μm，有效放大倍數不能超過2000倍。電鏡用的光源為電子槍產生的高速電子束，其波長比可見光短十萬倍以上，因而大大地提高了解析度。電鏡解析度接近0.lnm，有效放大倍數在百萬倍以上。

在電子顯微鏡下可觀察病毒粒體外形、大小以及在寄主細胞中的位置等。植物病毒粒子常見的有球形、長桿狀、線形和彈狀。

2 制樣技術

樣品處理技術多種多樣，適用於不同的材料和觀察目的。如金屬投影和復型技術，主要用於病毒或其他大分子的表面結構和大小觀察；冰凍蝕刻用於細胞化學、生物膜等研究；另外還有放射自顯影電鏡技術、免疫電鏡技術等。而植物病毒學上廣泛應用的是負染技術和超薄切片技術。負染制樣操作簡單，所需時間少；而超薄切片制樣方法操作復雜，所需時間長，但這種方法可以觀察到病毒粒子在組織中的情況。

2.1 負染技術

負染是相對正染而言的。是指在樣品的周圍包被高電子密度的染料，背景呈深色，而樣品呈白色，反襯出樣品的輪廓。病毒負染後能很清楚地看到其大小和細微結構。此法簡便、易行、快速，為病毒診斷提供了一種可靠手段。現在鑒定病毒，一般先用病汁液做負染觀察，根據看到的病毒的大小和形狀等，能為進一步研究提供許多有用信息，如採用什麼方法提純、病毒的分類地位如何等。其中有六個病毒屬的形態特徵非常典型，幾乎可以憑此特徵就能確定它們屬於哪個病毒科、屬，見表1。

表1 六個典型特徵病毒屬

pH調節用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而鉬酸銨用醋酸銨調，甲酸鈾用氫氧化銨調。

強大電子束的轟擊，是造成病毒變形和失去結構細節的另一重要原因，觀察時要採用盡量低亮度光斑，動作迅速，以減少轟擊時間。Forvmor膜等在電子束照射下，容易漂移，這樣病毒會被拉長或拉寬，因此，在測量病毒顆粒大小等精確觀察時，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加噴一層碳膜。

（5）病毒粒體大小測量 目前病毒學工作者已經注意到，同一病毒的大小不一樣，有些甚至相差甚遠。這可能是由於不同分離物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由於實驗誤差或方法上的差別造成的。測量病毒大小，一般不宜提純病毒，而要用病株粗提液。因為病毒在提純過程中的形態結構，會由於提純過程中離子環境等的變化和物理因素的影響發生而變化。染色要用兩種以上染料，測量病毒顆粒的數量要盡量多，尤其是線狀病毒容易斷裂，數量應在100個以上。

2.2 超薄切片技術

根據電鏡成像原理可知，用於電鏡觀察樣品其厚度要求在數十納米，而通常單個細胞的厚度在數十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用於光鏡的切片機，其切片厚度一般在單個細胞水平，所以電鏡觀察必須做超薄切片。

超薄切片一般程序為：取材—固定—脫水—包埋—切片—染色—電鏡觀察。

（1）取材 取材要求典型、迅速，機械損傷小。材料切成1mm3大小，離體後1min之內進入固定液。應取不同寄主材料、同一寄主的不同組織和不同接種時期的樣品。

（2）固定 是用物理的或化學的方法迅速將細胞殺死，並且盡可能地使保存和固定細胞內各種結構、生物大分子生活時的狀態和位置。電鏡中常用的固定方法是化學固定。常用四氧化鋨、戊二醛、高錳酸鉀或重鉻酸鉀等固定劑。在病毒學中一般採用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化鋨（用0.2mol/LPBS，pH7.2配製）雙固定法，這樣細胞中的多種成分，如蛋白質、脂類、多糖、核酸等，大部分都能固定下來。戊二醛固定12～24h，四氧化鋨固定2～4h。戊二醛遇到鋨酸會形成沉澱，因此戊二醛固定後一定要用緩沖液充分清洗後再進行四氧化鋨固定。固定在超薄切片中很關鍵，固定液的種類、濃度、pH、滲透壓、離子組成、固定時間、溫度和方式都與固定的質量密切相關。因此，整個固定過程應該在4℃下進行。固定劑一定要用緩沖液配製。固定好的材料，電鏡下細胞內各種膜系統應該完整，沒有斷裂，雙層膜要基本平行，細胞質呈精細顆粒狀，沒有空白。固定後緩沖液要充分清洗後再進行下面的步驟。

（3）脫水 常用的包埋劑是疏水的，因此包埋前要用既親水又親脂的乙醇或丙酮進行脫水。從低濃度到高濃度的脫水劑脫水，最後用絕對無水的脫水劑脫水。

（4）包埋 包埋的目的是增強樣品的機械強度，使樣品具有一定的機械形狀，適於切片機工作；另一個重要作用是進一步固定細胞結構。包埋劑種類很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等環氧樹脂。包埋過程中發生的化學反應，叫聚合過程。聚合過程中實際上發生了兩類反應，一類是環氧樹脂末端環氧基之間在胺類化合物（如DMP-30）催化下，化合生成長鏈；另一類是樹脂中間的羥基和交聯劑（也稱固定劑）的酸酐發生反應，生成橫向連橋，加固了樹脂分子之間的聯系。為了增強樹脂聚合形成的包埋塊的切割性能，常加入一些增塑劑，如樹脂、催化劑、固化劑。

（5）切片 准確、熟練地掌握切片機操作技術，包埋塊軟硬適度，修塊好，就能切出要求質量的片子來。這里技巧很重要。

（6）超薄切片的染色 也叫電鏡技術的正染色。觀察內容不一樣，採用染色方法不同，病毒內含體和細胞病理學研究則常用醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛染色法。切片在1%～2%醋酸雙氧鈾中染色20min，用50%乙醇沖洗後用檸檬酸鉛染色30min，0.01mol/L NaOH沖洗。染色的關鍵是要防止醋酸鈾和檸檬酸鉛生成沉澱。防止污染的主要措施是防止CO2和檸檬酸鉛反應。如用剛制備出的蒸餾水配製染料和沖洗劑，染色時在小室中進行，小室中放入吸收CO2的固體NaOH，防止人呼吸時CO2進入小室中，戴口罩等。染色和沖洗完畢，切片自然乾燥後就可以電鏡觀察。

電子顯微鏡的出現及各種電鏡技術的發展，為植物病毒的直接觀察起到了巨大的推動作用，使檢疫工作人員能得到受病毒感染的病毒粒子電鏡照片以作為直接證據。但電鏡觀察結果需要和其他方法的檢測結果相結合，才能確定病毒的分類地位。這是因為許多病毒都有類似的形態和結構。由於一些植物汁液中病毒濃度過低，在進行常規的電鏡觀察檢測中，很難發現病毒粒子，這樣就要求對一些植物病毒進行分離和提純，以便進行有效的電鏡觀察和其他理化檢測。病毒的分離和提純主要是採用差速離心、PEG沉澱的方法，進一步的純化則採用密度梯度離心和柱層析法。為了直接檢測植物體內的帶毒情況，常採用植物組織的超薄切片和電鏡觀察進行。超薄切片的電鏡觀察可以直接用於對植物組織內部的病毒形態、內含體形態、病毒所在的部位、受感染的植物組織發生的病理學變化等進行檢查。