雙熒光素酶報告需要什麼設備

1. 熒光素酶報告基因的技術流程

（1） 用生物信息學方法分析並預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點。
（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。
（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆並提純質粒備用。
（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時准備相應的空載質粒對照，提純備用。
（5） 培養293（或其它目的細胞），並接種於24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。
（7）提取蛋白並用於熒光素酶檢測。
（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。
（9） 計算相對熒光強度，並與空載對照比較。

2. 檢測熒光素酶報告基因發出熒光的都有什麼儀器 例如各有什麼優缺點之類的

Luminex,熒光分光光度儀,熒光凝膠成像儀,液閃儀 ,熒光酶標儀,熒光顯微鏡
都很貴.推薦熒光酶標儀和熒光顯微鏡.
Luminex是液體晶元測定,同時檢測30個目的蛋白,定量,靈敏.
熒光分光光度儀用途比較局限,不方便.
熒光凝膠成像儀的對象是凝膠
液閃儀和luminex很像,但是只能檢測一個蛋白或靶標
熒光酶標儀就是酶標儀,但是可以檢測熒光信號,同時可以測定至少96個樣品的單一靶標
熒光顯微鏡不能定量,但非常直觀,可以看到是那些細胞發光,以及發光的部位.而且可以同時看到1-3種熒光,價格比前者低些.

3. 雙熒光素酶報道系統詳解

一、概述

報告基因 (reporter gene):是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。

  一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。

在基因表達調控的研究中，報告基因被廣泛應用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。

熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶的統稱，哺乳細胞無內源性熒光素酶。

熒光素酶報告基因的優點

蛋白不需要翻譯後加工，所以一旦翻譯立即產生報告活性。

在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發光。

檢測快速，每個樣品只需幾秒鍾

二、實驗原理

利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構建成熒光素酶報告質粒。然後轉染細胞，適當刺激或處理後裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前後或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。

同時，為了減少內在的變化因素（如：培養細胞的數目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率等）對實驗准確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質粒（phRL-TK）作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II (LARII)時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之後，再在同一樣品中加入Stop & Glo® 試劑，將上述反應淬滅，並同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。

三、操作程序與結果判定

A．檢測前相關試劑配製

1.  1X PLB裂解緩沖液配製：將4×體積水或PBS加入1×體積5X PLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X 緩沖液，平衡需2-3 mins）。

2.  Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配製：將Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合後，分裝，置於-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復凍融），使用前將配好的LAR II從-20℃拿出，並平衡至室溫（需20-30min）。

3.  Stop & Glo® Reagent配製：現用現配，先將Stop & Glo® Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50X Stop & Glo® Substrate加入49倍體積的將Stop & Glo® Buffer中。

B．樣品制備

1.  仔細地將生長培養基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，並盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。

2.  24 孔板每孔加入100-150μl 1X PLB裂解緩沖液以覆蓋細胞，然後將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。

C．雙熒光素酶檢測方法（Promega GLOMAX） (註：系統運行時請勿觸摸操作屏)

1.  重新設定系統：Tools  Settings    Reset

2.  雙熒光素酶檢測程序的設定：

Protocols      Run Promega Protocol      DLR-O-INJ    OK

3.  將50μl LAR II加入1.5ml EP管中（專用的進口EP管），取10μl 細胞裂解液加入裝有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），置於檢測儀，點擊「Measure」 開始讀數（為螢火蟲熒光素酶反應強度）。（使用前LAR II要混勻，並平衡到室溫）

4.  測量結束後，取出EP管，再加入50μlStop & Glo® Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），再次置於檢測儀，點擊「Measure」 開始讀數（為內參海腎熒光素酶反應強度）。（Stop &

Glo® Reagent 現配現用，不能保存）

5. 記錄讀數: 每個樣品會有3個數值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應強度, RLU2——內參海腎熒光素酶反應強度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般記錄Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉染效率，也可根據實際熒光強度來調整報告質粒與內參的比例。

6. 測量完畢後，請將最後檢測的EP管取出後，關閉儀器。

7. 實驗結果的處理與分析：採用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

四、注意事項

1. 由於溫度對酶反應有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫後再進行測定。

2. Renilla熒光素酶檢測工作液需配製後立即使用，不可配製成工作液後長期保存。

3. Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反復凍融，保證每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20可穩定保存一個月，在-70℃可穩定保存一年。

4. 試劑保存和使用時都應避光。

5. 為取得最佳測定效果，測定時，樣品和測定試劑混合後到測定前的時間應盡量控制在相同時間內（1-2秒）。

6. 使用過程中切勿接觸操作屏（程序會被終止或取消）。

7. 平時盡量不要移動儀器，防止觸摸屏走位。

4. 雙熒光素酶檢測啟動子和熒光定量檢測啟動子有什麼不同

熒光素酶（Luciferase）是生物體內催化熒光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化發光的一類酶的總稱，來自於自然界能夠發光的生物。

自然界存在的熒光素酶來自螢火蟲、發光細菌、發光海星、發光節蟲、發光魚、發光甲蟲等。細菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細胞的應用中受到限制。目前，以北美螢火蟲蟲(Photinus pyralis)來源的熒光素酶基因應用的最為廣泛，該基因可編碼550個氨基酸的熒光素酶蛋白，是一個61kDa的單體酶，無需表達後修飾，直接具有完全酶活。

發光機制

生物熒光實質是一種化學熒光。螢火蟲熒光素酶在Mg2+、ATP、O2的參與下，催化D2熒光素(D2luciferin) 氧化脫羧，產生激活態的氧化熒光素，並放出光子，產生550～580 nm 的熒光，其化學反應式如下。

這種無需激發光就可發出偏紅色的生物熒光，其組織穿透能力明顯強於綠色熒光蛋白(GFP)。熒光素酶是靠酶和底物的相互反應發光，特異性很強，靈敏度高，由於沒有激發光的非特異性干擾，信噪比也比較高。

二、熒光素酶報告基因的檢測流程

1、重組質粒制備: 制備含有待檢測基因-Luc/Rluc的重組質粒；
2、細胞系選擇: 根據實驗需要選擇細胞株，通常選擇轉染效率較高的293T細胞或原代細胞等；
3、共轉染: 將帶有Luc/Rluc標記的報告基因和目的基因進行共轉染，設置不同的檢測時間點，一般為24h/48h；
4、外界干預: 轉染後，可進行物理/化學/病毒等的相應刺激；
5、細胞處理: 採用進口/國產雙熒光素酶檢測試劑盒依照protocol操作；
6、熒光檢測: 使用GENios Pro 酶標儀或具有類似檢測功能的設備進行熒光強度檢測。

三、熒光素酶報告基因的優點

1、優越的靈敏度，比Westernbloting靈敏度高1000倍以上；
2、內源性低，哺乳動物無內源性表達；
3、熒光素酶檢測不受細胞內其他物質影響；
4、發光檢測，檢測方便；
5、靈敏度高，10‐20摩爾熒光素酶分子；
6、檢測范圍廣，大於7個數量級。

5. 如何使用多功能酶標儀檢測雙熒光素酶

報告基因檢測被廣泛應用於研究基因表達及外部刺激下原核和真核細胞的反應。Luciferase報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。但是報告基因實驗中往往會受到各種實驗條件的影響，例如培養細胞的數目和活力的差別、細胞轉染和裂解的效率、以及加樣操作過程中引起的變異。Dual-Luciferase雙熒光素酶報告基因檢測系統中含有在同一細胞中同時表達的兩種熒光素酶。共轉染的「對照」報告基因會作為內對照，減小細胞活性和轉染效率對實驗的影響。因此雙報告系統減少了外部干擾，使得實驗數據更可信。Promega提供了一種先進的雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試，該技術同時使用兩個獨立的報告基因以提高實驗的准確性，Biotek synergy 系列微孔板檢測儀作為雙報告基因的檢測分析平台獲得了Promega DLR 認證。
在雙報告基因系統中，通常一個報告基因用於檢測特定實驗條件下待測物的反應，即「實驗」reporter，另一個報告基因用來檢測實驗條件，類似於內部對照，用於校準「實驗」reporter的數據。通過這種方法，可減少內在的變化因素所削弱的實驗准確性，例如：轉染效率、細胞活性、細胞裂解差異以及加樣操作過程中引起的差異。Promega公司的Dual-Luciferase系統利用螢火蟲和海腎熒光素酶的活性分別檢測實驗組和對照組。螢火蟲熒光素酶是一種分子量為61KD的單體酶，分兩步催化蟲熒光素的氧化反應，產生560nm的光，海腎熒光素酶是一種分子量為36KD的單體酶，催化海腎熒光素的氧化反應，產生中心波長為480nm的藍光。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶沒有種源同源性，對應不同的反應底物，反應中沒有任何的交叉干擾。

6. 怎麼使用多功能酶標儀檢測雙熒光素酶報告基因

以Promega公司雙熒光素酶檢測試劑盒為例：
1. 試劑准備
按照說明書配製PLB細胞裂解液、LAR II檢測液、Stop&Glo檢測液。

2.儀器准備
准備單管或微孔板發光檢測儀

3. 樣品准備
按照說明書使用PLB細胞裂解液裂解細胞，取20ul細胞裂解液

4. 檢測過程
a) 在1.5ml離心管中加入20ul細胞裂解液，然後加入100ul的LARII溶液，混合後放入發光檢測儀檢測第一次發光值；
b) 然後加入Stop&Glo檢測液，終止第一次發光，同時開始第二次發光，混合後放入發光檢測儀檢測第二次發光值。

7. 雙熒光素酶報告基因系統promega 多少錢

免疫沉澱 當然，確定miRNA與mRNA之間的互作，我們還有更直接的方法，那就是從實驗上尋找物理相互作用。我們可以利用RNA誘導沉默復合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗體進行免疫共沉澱（co-IP）。生物通 目前更先進的方法是通過紫外線照射以交聯復合物，然後開展深度測序以鑒定發現的RNA，這種方法被稱為紫外交聯免疫沉澱結合高通量測序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用這種方法來尋找miRNA的靶基因，能夠明顯降低miRNA結合位點的假陽性預測率，並且縮小miRNA結合位點的空間范圍，可在全基因組范圍內鑒定AGO蛋白與不同RNA上的結合。現在有多家公司提供CLIP-seq服務，如銳博生物。 Clontech公司（Takara旗下）也推出了一種新工具，能協助鑒定細胞中的miRNA靶點。這一工具名為MirTrap系統。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體，允許miRNA與其目標結合，但限制進一步的加工。此亞基整合到內源的Argonaute/RISC復合物中，並「鎖定」miRNA-目標mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK（FLAG表位）標簽有助於整個Ago/RISC復合物的捕獲和分離。這樣就能實現miRNA及其目標的免疫沉澱，從而通過新一代測序或定量PCR來鑒定或定量。生物通 整個過程大致如下： 1. 創建miRNA模擬物。生物通 2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉染到哺乳動物細胞，並孵育24小時。同時利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對照載體開展對照轉染。 3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉染後的細胞培養物。生物通 4. 利用分離試劑盒中的磁珠對RISC復合物（其中包括靶標mRNA）進行免疫沉澱。 5. 利用附帶的NucleoSpin RNA XS試劑盒分離與磁珠結合的靶標mRNA。 6. 通過qPCR或新一代測序分析分離出的RNA，鑒定出特定miRNA的靶標mRNA。 Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文庫讓研究人員能夠在實驗室內開展全轉錄組范圍的miRNA和ncRNA靶基因鑒定。它是個全轉錄組范圍的cDNA文庫。在文庫轉染和選擇之後，細胞被已知miRNA轉染。對於那些包含與miRNA相互作用的cDNA的細胞，它們將生存到第二輪。那些選擇出的cDNA可通過測序來鑒定。這樣，研究人員只需投入很少，就能實現大范圍的篩選。 靶基因的驗證 預測終歸是預測，miRNA的靶基因還必須經過驗證。這個過程與一開始尋找靶基因的過程相似，也就是抑制或過表達miRNA，然後檢查mRNA或蛋白水平的反應。生物通 目前最常用的方法是熒光素酶報告基因法。首先，構建熒光素酶表達載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3』UTR插入熒光素酶基因的3』UTR中，然後將構建好的重組載體轉染到細胞中，並改變miRNA的表達水平，最後檢測熒光素酶的表達情況，以分析3』UTR中是否含有miRNA的靶位點。 目前有多家公司提供熒光素酶報告載體或構建服務。Promega就提供pmirGLO雙熒光素酶表達載體。它採用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶這兩種報告基因，其中螢火蟲熒光素酶（luc2）作為主要報告基因，其表達減少意味著內源性的或外源引入的miRNA 與克隆的miRNA 的靶序列發生了結合；海腎熒光素酶/新黴素基因（hRluc-neo）作為對照報告基因，既能實現歸一化處理，又能篩選穩定轉染的細胞系。這樣就以一個載體實現了以往兩個載體的功能。 就目前而言，預測和鑒定miRNA靶基因的方法雖然不少，但仍然沒有一種常規方法。隨著計算機演算法的不斷改進和生物學技術的快速發展，這種現狀有望改變。讓我們拭目以待吧。

8. 雙熒光素酶報告基因檢測實驗技術服務

1、  實驗簡介

Luciferase報告基因系統是以 熒光素(luciferin) 為底物來檢測 螢火蟲熒光素酶 (fireflyluciferase)活性的實驗。熒光素底物會在熒光素酶作用下會發光（波長540-600nm），且光強能反應熒光素酶的表達量。熒光素酶的蛋白表達量與啟動子活性、mRNA的穩定性及翻譯效率相關。從而將待測啟動子、UTR等序列與熒光素酶ORF框融合表達，再檢測其發光強度，就能判斷這些序列對蛋白表達的影響

為了減少實驗誤差，同時轉染一個能穩定表達的 腎熒光素酶 的質粒作為內參，催化 腔腸素 氧化產生藍光（波長460-540nm）；所以叫雙熒光素酶報告基因檢測。

2 . 實驗流程圖

3 . 服務內容：雙熒光素酶報告檢測啟動子活性服務主要分為以下兩種：

a .   啟動子活性分析，用於檢測待測啟動子是否有活性及其活性區域；

b .   啟動子與轉錄因子結合驗證，用於研究某轉錄因子是否調控某基因的待測啟動子，以及它們的結合區域

項目 服務內容 結果交付 實驗周期 客戶提供

啟動子活性分析 合成和構建2kb啟動子熒光素酶載體載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告30工作日1、細胞

2、基因信息

構建截短啟動子熒光素酶載體載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告

細胞培養和雙熒光素酶檢測檢測數據和實驗報告

啟動子與轉錄因子結合驗證 合成和構建野生型啟動子熒光素酶載體載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告30工作日[if !supportLists]1、 [endif]細胞

[if !supportLists]2、 [endif]基因及轉錄因子信息

構建突變型啟動子熒光素酶載體載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告

構建轉錄因子表達載體載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告

細胞培養和雙熒光素酶檢測檢測數據和實驗報告

 

4. 送樣要求

a.重組載體：

質粒不少於2ug，或甘油菌約100ul

b.細胞：

活細胞，2個T25瓶，細胞匯合度＞80%（廣州市內）；或凍存細胞2管（廣州外地區）

備註：載體或細胞可由如期代為構建或購買

 

5. 樣本保存和運輸要求：

a. 質粒或甘油菌可用冰袋保存運輸；

b. 活細胞常溫取樣；

c. 凍存細胞乾冰取樣/運輸：需要至少在送樣前一天通知我方