Ⅰ 干货分享 | 活性氧ROS的流式检测
活性氧（ROS）的流式检测通常采用荧光探针DCFH-DA，其原理在于DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，随后在细胞内ROS作用下氧化生成发荧光的DCF，荧光强度与ROS水平正相关。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测，激发波长为480nm，发射波长为525nm。
选择荧光探针时，DCFH-DA是常用选项，其工作原理为：无荧光的DCFH可自由穿过细胞膜，一旦进入细胞，被酯酶水解成DCFH，随后在细胞内的ROS作用下氧化生成DCF，具有荧光。荧光强度与ROS水平成正比。
荧光探针DCFH-DA的装载分为原位装载和收集细胞后装载两种方式。对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，推荐先装载探针，后用活性氧阳性对照或药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针适用于贴壁培养细胞。按照1:1000稀释DCFH-DA至10微摩尔/升，去除细胞培养液，加入适当体积的DCFH-DA，充分盖住细胞，通常不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。在刺激细胞20-30分钟后，活性氧阳性对照可显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针方法适用于悬浮细胞。按照1:1000稀释DCFH-DA至10微摩尔/升，细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟，每隔3-5分钟颠倒混匀，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。在刺激细胞20-30分钟后，活性氧阳性对照可显著提高活性氧水平。
检测步骤包括激光共聚焦显微镜观察或荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光强度变化。DCF的荧光光谱与FITC相似，可用FITC参数设置检测DCF。
流式方法检测需提供实验细胞和刺激药物。流程为细胞培养、加药刺激、细胞标记、流式上机检测、结果分析。结果包括流式原始数据、数据分析结果和实验报告，内容涉及仪器、试剂及实验步骤。