A. PCR实验室污染了怎么处理
A. 实验室进行通风处理,至少2 周的时间;
通风可加速扩增产物的消散的速度
B. 使用清水对实验台面、实验室进行清洗;
DNA不溶于酒精,使用清水多次擦拭后可消除附在实验台面等的核酸DNA;
C. 使用紫外灯进行房间的照射;
紫外线及产生的臭氧都有破坏DNA结构的作用
D. 之前使用的灭菌锅使用清水清洗多次,不要和耗材等在一起灭菌;
E. 可用1mol/L 的盐酸对可疑器具或者实验台面进行浸泡或擦拭。
盐酸可使DNA脱嘌呤,破坏DNA的结构。
F. 若有条件,选择一个新的实验环境进行检测实验最好。
B. PCR实验室污染如何预防
1.PCR实验室严格分区
整个检测过程应严格分区进行:PCR反应体系的配置区,标本处理、加样区,PCR扩增、荧光检测及结果分析区。各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。
2.进行PCR操作时,工作人员应该严格遵守SOP操作规程
操作人员应经过专业培训,具有一定经验和操作技能。
3.分装PCR试剂
当使用的 PCR 试剂盒,不是独立分装的反应液时,应将PCR反应液先配置好,然后分装到反应管-20℃保存,以减少重复加样次数,避免污染。PCR试剂、PCR反应液与样品及PCR产物分开保存,试剂盒里面的阳性对照、阳性参考品也应该与试剂分开放置,不应放于同一冰箱。
4.正确使用加样器
吸样时要特别小心,应缓慢匀速,避免液体溅到加样器头上。尽量一次性吸完,忌反复多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶。打出液体后拇指不应松开按钮,将吸嘴压掉后再将拇指松开,避免液体回吸。
5.做好实验室的清洁消毒
操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或 75%酒精、紫外线灯或臭氧消毒处理。 特别是实验完成后,应立即清洁工作台,并进行消毒。
6.做好实验防护
使用不含荧光物质的一次性手套、一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴吸头。选择质量好的离心管,以避免样本外溢和外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部,以防止管内液体溅出,造成污染。反应管中尽量避免气泡存在,管盖应盖紧。试剂准备和标本处理应使用超净工作台或防污染罩,以防止对环境污染。
C. 怎么防止PCR实验室污染
PCR实验室污染
标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。
PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见,因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。
污染监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
对照试验
1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。
2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。
3、重复性试验
4、选择不同区域的引物进行PCR扩增
防止污染的方法
进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
划分操作区:目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:
1. 试剂准备区。
2.标本制备区。
3. PCR扩增区及分析区。
切记:任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:
1.PCR用水应为高压的双蒸水;
2.引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;
3.引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。
实验操作注意事项
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:
1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;
2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;
3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;
4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;
8. 重复实验,验证结果,慎下结论