做蛋白wb需要什么仪器

⑴ Western blot实验需要准备什么试剂和耗材

试剂：tris、Hcl、Nacl、脱脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tween 20、一抗、二抗、显色剂及SDS PAGE需要的试剂（tris、Hcl、TEMED、SDS、过硫酸铵、丙烯酰胺、N N 甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、非预染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考马斯亮蓝R250）、预染蛋白Marker
耗材：滤纸、膜、乳胶手套等
仪器：电泳仪、电转槽、摇床、冰浴等

⑵ wb实验步骤

wb实验步骤如下：

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。

与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

wb实验原理及流程图如下所示：

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

⑶ wb实验的原理和步骤

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。

与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

WB 中常见的问题以及处理办法。

一、信号强度低

信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：

① 样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；

② 蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；

③ 蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。

④ 抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；

⑤ 蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；

⑥ 抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；

⑦ 甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。

二、非特异性条带或条带位置不对

WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：

① 抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；

② 样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；

③ 蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；

④ 细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；

⑤ 蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；

⑥ 蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。

三、背景过高

在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：

① 封锁不充沛。背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；

② 洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；

③ 抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；

④ 曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。

四、条带弥散或外形怪异

有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：

① 电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE 温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；

② 电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；

③ 上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。

④ 制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。

⑤ 电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。

五、膜上分布不平均的污点

有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：

① 试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；

② 转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；

③ 抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；

④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；

⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。

⑷ wb煮蛋白的机器叫什么

wb煮蛋白的机器叫全自动WB定量分析仪。根据查询相关资料显示，破碎胃癌细胞提蛋白做WB，全自动WB定量分析仪是一种用于生物学领域的分析仪器，全自动WB定量分析仪可自动进行各种蛋白质样品分离、免疫检测、定性和定量分析，广泛应用于蛋白质性质鉴定、蛋白质定量分析、蛋白质功能研究等。

⑸ western blot蛋白质处理要用到超声波呢超声波在里面起到什么作用呢有可以替代的方法吗

超声或涡旋都可以，超声的作用：机械性破坏细胞；将沉降的细胞混匀，因为含有western及IP裂解液，使细胞与裂解液充分接触。涡旋同样的道理：混匀 。间隔时间：5分钟

⑹ 做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

做好Western需要注意各种细节。工欲善其事，必先利其器，首先还是从蛋白提取开始谈起。

1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现用），RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，计算用量。以收集六孔蛋白为例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使用的试剂RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制剂混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购自***公司）
2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul刚配好的裂解液，立即置于冰上，在摇床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份备用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一块组织后立即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋白有影响，最好用新鲜样品实验）
2.配制细胞裂解液（现配现用），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。
3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃，使用时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min。

我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下：
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配制：

戴好口罩和手套，选用1.0mm玻板，用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上，夹紧，向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液，将板子中水倒出，倒扣晾干。

1.配制8ml 10%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入，以免胶浓度不均匀，避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当水和胶之间出现一条水平的折线时，即已凝固。
2.待分离胶凝固后，将水封的蒸馏水倒出，可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶，加满后冲洗10孔梳子，水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。
3.此时，可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使用时需小心。
2.灌胶时视线与胶面水平，注意操作，避免胶溅入眼睛中。
3.常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹子、梳子一同放入蒸馏水中，4℃过夜保存。

1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，十几分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直至不漏液为止。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压至80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调至100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现一条蓝色的buffer条带，此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。
注意：避免蓝色条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时，即停止电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样，观察几分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。
2.一般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显示在本实验室实验仪器下，我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了几次重复实验，结果均一致。因此，总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况，尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片，标好面积和孔数（即样品数），存好以后随时使用。
5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。

电泳结束后，取出玻璃板，稍微冲洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶，为了防止切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。

1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下面放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖子，根据膜的总面积调整电流，电转2h。
3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积：
以一块膜为例，封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml，需要13ml，则配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存（若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×，常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜，有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想，换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，一卷有些贵，但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚高不说，而且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转方式，有些采用湿转，有些采用半干转，两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。

1.电转结束后，根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角，以清楚哪一条带是1号样品。
2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参，室温摇床上孵育2h。根据盒子大小，加入封闭液的量需没过膜。

1.配制p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀释，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混匀，现配现用。
配制actin一抗（ 公司），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。
2.将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。

次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min。

1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混匀，现配现用。
2.TBST洗完膜后，加入二抗，室温摇床上孵育2h。

1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min。
2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算用量，提前4℃混合好发光液A和B。
3.到暗室中加混合好的发光液，在胶片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光胶片，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放入自来水中。出暗室后，将胶片挂起晾干。
也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间，多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来用Bio-rad凝胶成像系统照相，对比结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加干净，之后就一直用成像仪曝光照相了。
2.夹取胶片可用普通镊子，但也只夹胶片左上角，避免损害胶片上曝光的蛋白条带。
3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光，可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经足够。

若显影效果不好，可将膜重生，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋白印迹膜再生液，室温摇床30min。

⑺ Western blot实验需要准备什么试剂和耗材

1.1细胞

①将细胞培养皿置于冰上，用冰冷得PBS洗涤细胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧云天P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

b.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）

③用刮刀刮下贴壁细胞，转移至EP管，14000rpm离心5分钟

④将上清液转移至EP管，负20℃保存

1.2组织

①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）

②加入裂解液

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果组织样品本身细小，可适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分

（每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同）

③充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清

2. 蛋白定量（Thermo UF289356)

2.1稀释白蛋白(BSA)标准液的制备

2.2 制备BCA工作液（A液：B液=50：1 密闭室温可以保存一段时间）

总体积=（#标准孔+#未知孔）*#复孔*每个样本的体积

测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。

2.3 浓度测定

①将25ul标准液和样本设置复孔加入96孔板，按照样本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果样本有限就加10ul比例用1：20；推荐每个待测的样本做2-3个平行反应；根据样品的浓度，可提前稀释5-10倍)

②最好摇匀30秒，将96孔板在37℃孵育30min

③冷却至室温，酶标仪设置为562nm，在5分钟内测试完所有的样本。

④所有的样本减去空白对照在562nm处的吸光度，绘制标准曲线，确定样本的浓度

3. 蛋白电泳

3.1 变性以及还原蛋白

在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸。

3.1.1室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合。

3.1.2 100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白

3.1.3 冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可

3.1.4通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近则可以停止电泳

4. SDS-PAGE凝胶电泳

4.1 胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）

4.2 配胶（碧云天P0012AC）

洗干净玻璃板，装板加水验漏后，晾干装到制胶架上。根据配方配胶。

（配胶顺序：先配分离胶（下层胶），充分凝固后，再配浓缩胶（上层胶））

4.2.2 配制浓缩胶（上层胶）

4.2.3 组装制胶器

①将制备好的分离胶灌入制胶板内（缓慢不要有气泡），随后缓慢加入适量异丙醇压平分离胶。

②20-30分钟分离胶凝聚完成，倾斜板，倒掉异丙醇，吸水纸吸去残余液体，弃去上层压胶的水或醇。

③加入配好的浓缩胶灌入制胶板内，然后插上梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝聚。

④缓慢取出梳子，上样。

4.2.4 上样及电泳

①蛋白冰上溶解，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶板，放入电泳槽

②两块板之间倒入电泳液，确认无漏液

③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹孔使碎片冲出

④依次加入蛋白marker和蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。（上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）

⑤调节电泳的电压和时间，传统胶是上层胶80V，30min;下层胶120V 90-120min.

(为了防止蛋白条带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)

5. 转膜

将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白条带容易子啊凝胶中扩散，而且抗体也不易于进入凝胶中与目的蛋白结合，所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭、洗涤，显色等实验操作。

5.1 转膜

①将减好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作

②装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）

黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。

⑻ wb实验的原理和步骤

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上。

再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

(8)做蛋白wb需要什么仪器扩展阅读：

WB，蛋白质印迹（Western blotting）又称免疫印迹（immunoblotting）,是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白的方法，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

一、蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3 蛋白定量
4 电泳上样样品的准备

二、电泳

1 PAGE 胶的制备
2 蛋白分子量 Marker
3 阳性对照
4 内参对照
5 上样与电泳

三、转膜与显色（ Western Blot）

1 胶中蛋白的检测
2 蛋白转膜
3 膜上蛋白的检测：丽春红
4 膜的封闭
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 显色

四、常见问题分析与解决方案
五、试剂及缓冲液配方

一、蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。

蛋白提取总体原则与注意事项包括：

1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。

2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。

3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。

4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。

5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

⑼ western blot实验都需要哪些仪器

western blot实验都需要的基础仪器有： 电泳仪，制胶板，电泳槽，湿转的转膜槽或者半干转仪，脱色摇床，暗室，X光片，红外灯，成像仪，一些基础耗材和试剂等 基本上生化实验室要做western blot还是很容易的