什么仪器可以打印nc膜

❶ 点膜机工作原理

传统的平台式点膜是等快速诊断试纸的专业制作仪器之一，作用是将C/T线抗体喷点到NC膜介质上，同时将标记物均匀地定量喷点到聚脂膜或玻璃纤维膜上，适合各类试纸

❷ 胶体金试纸条开发服务实验报告——钟鼎生物

实验报告

摘要

将一抗（单链抗体）标记到 胶体金 ，将抗原固定到试纸条上，通过竞争法定性检测待测标本中的抗原。要求：检测灵敏度达到5μg/mL。

1 试剂和耗材

名称公司名称公司名称公司

A α2b注射液20μg/mL、金标抗体：单链抗体、质控线包被蛋白：标签抗体、检测线蛋白：抗原客户提供吸水纸、底板、玻纤（金标释放垫）、玻纤（样品层析垫）、硝酸纤维素膜Millipore胶体金溶液、封闭液、金复溶液南京钟鼎生物

2 主要实验仪器材料

仪器名称公司仪器名称公司

离心机：Mini-14k型杭州奥盛仪器有限公司喷点系统（划膜仪）：HM3030型、斩切机：ZQ2002 型上海金标

3 实验步骤

3.1 标记

取1支1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL胶体金加入管中，向管中加入14μL0.2M碳酸钾后震荡离心管使其混合均匀，加入8μg单链抗体，混匀后反应20min。加入200μL10%BSA封闭反应20min。在11000r/min 转速下离心20min。弃去上清，用2mL 金复溶夜将沉淀复溶后铺在6mm×300mm的金垫上干燥。

3.2 点膜

将客户提供的抗原稀释至2mg/mL，用点膜仪喷点在NC膜上作为检测线，将客户提供的标签抗体稀释至0.6mg/mL，喷点在NC膜上作为质控线，55℃烘干箱干燥2h。

3.3 组装检测

在底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫（两层）、样品层析垫，用斩切机切成4mm宽的试纸条装入卡壳中用以检测。

3.4 金标抗体的验证及灵敏度测试

检测方法是用样品稀释液将A α2b注射液按照1:1的比例稀释，然后取稀释后的样品60μL滴于试纸条加样孔上，10min后判读结果。

图1 A α 2b不同浓度以及阴性对照结果

1：样品稀释液

2：0.5 μg/mL A α2b

3：2.5 μg/mL A α2b

图1左1试纸条CT线都比较明显，2号T线位置未完全抑制，3号基本完全抑制，试纸条检测重组人干扰素α 2b的灵敏度在5μg/mL左右。

3.5 加速稳定性实验

用以上方法制作的试纸条放入37℃环境下3天和7天后，再拿出来检测，结果如图2和图3。

图2 试纸条37℃3天检测结果

1：2.5 μg/mL A α 2b

2：0.5 μg/mL A α 2b

3：样品稀释液

图3 试纸条37℃7天检测结果

1：样品稀释液

2：0.5 μg/mL A α 2b

3：2.5 μg/mL A α 2b

图 2、3 中可以看出试纸条在 37℃下保存 7 天对检测性能没有太大影响。

4 结果讨论分析

经过以上实验，试纸条检测重组人干扰素α 2b注射液的灵敏度在5μg/mL左右，试纸条在4℃密封条件下能稳定保存 6个月左右。

南京钟鼎生物技术官网

❸ 做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

做好Western需要注意各种细节。工欲善其事，必先利其器，首先还是从蛋白提取开始谈起。

1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现用），RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，计算用量。以收集六孔蛋白为例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使用的试剂RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制剂混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购自***公司）
2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul刚配好的裂解液，立即置于冰上，在摇床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份备用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一块组织后立即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋白有影响，最好用新鲜样品实验）
2.配制细胞裂解液（现配现用），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。
3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃，使用时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min。

我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下：
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配制：

戴好口罩和手套，选用1.0mm玻板，用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上，夹紧，向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液，将板子中水倒出，倒扣晾干。

1.配制8ml 10%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入，以免胶浓度不均匀，避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当水和胶之间出现一条水平的折线时，即已凝固。
2.待分离胶凝固后，将水封的蒸馏水倒出，可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶，加满后冲洗10孔梳子，水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。
3.此时，可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使用时需小心。
2.灌胶时视线与胶面水平，注意操作，避免胶溅入眼睛中。
3.常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹子、梳子一同放入蒸馏水中，4℃过夜保存。

1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，十几分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直至不漏液为止。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压至80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调至100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现一条蓝色的buffer条带，此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。
注意：避免蓝色条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时，即停止电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样，观察几分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。
2.一般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显示在本实验室实验仪器下，我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了几次重复实验，结果均一致。因此，总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况，尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片，标好面积和孔数（即样品数），存好以后随时使用。
5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。

电泳结束后，取出玻璃板，稍微冲洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶，为了防止切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。

1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下面放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖子，根据膜的总面积调整电流，电转2h。
3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积：
以一块膜为例，封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml，需要13ml，则配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存（若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×，常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜，有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想，换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，一卷有些贵，但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚高不说，而且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转方式，有些采用湿转，有些采用半干转，两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。

1.电转结束后，根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角，以清楚哪一条带是1号样品。
2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参，室温摇床上孵育2h。根据盒子大小，加入封闭液的量需没过膜。

1.配制p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀释，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混匀，现配现用。
配制actin一抗（ 公司），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。
2.将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。

次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min。

1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混匀，现配现用。
2.TBST洗完膜后，加入二抗，室温摇床上孵育2h。

1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min。
2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算用量，提前4℃混合好发光液A和B。
3.到暗室中加混合好的发光液，在胶片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光胶片，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放入自来水中。出暗室后，将胶片挂起晾干。
也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间，多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来用Bio-rad凝胶成像系统照相，对比结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加干净，之后就一直用成像仪曝光照相了。
2.夹取胶片可用普通镊子，但也只夹胶片左上角，避免损害胶片上曝光的蛋白条带。
3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光，可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经足够。

若显影效果不好，可将膜重生，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋白印迹膜再生液，室温摇床30min。

❹ 硝酸纤维素膜NC膜的应用技巧

从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力H键静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：
1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
2. 膜对结合的影响
1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。
另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
1> 生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。 2> 处理过程不同。
3. 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
少量NACL，减少信号强度，消假阳。
有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置，可以消假阳。
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种：流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头，可以将不合格的半成品大板重新复活。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响，具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。
硝酸纤维素膜NC膜
规格: 15X20cm
孔径: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保质期一年
产品简介: 本品外观洁白，膜正面呈光泽，与水接触应立即浸润，不能立即浸润老者视为失活，不能点样，膜面有花斑或有粉性结构皆视为次品。用于转移电泳，宜选孔经0.22或0.45，以保证膜的强度，并减少穿透损失，硝纤膜过份干燥时脆,湿时有弹性，操作时室内应保持中常温度，避免过份干燥，防止发脆，本品静电吸附膜的亲水性好，渗滤时间适中，蛋白吸附力强，转膜的蛋白集中而不扩散，显色的灵敏度和特异性高，背景低。

❺ 如何选择胶体金试纸制作仪器，耗材，原料

一． 制作仪器 用途：将C、T线抗体喷点到NC膜上，形成测试线条。同时将胶体金喷点到玻璃纤维垫上。 喷点仪器现在市面上使用最多的是BIODOT仪器，产地为美国BIODOT公司，国内代理商为基因有限公司。 该仪器又分为三种类型。 1． 喷膜仪器 目前型号为XYZ3050，原来老型号为XYZ3000。称XYZ，是来源于它可以全数字控制三维运动喷点。 XYZ3000在这个行业的很多单位里都是能看到的。之所以称为喷膜，就是因为可以使用BJQ3000这款喷头，以不接触膜（在膜上方）的方式将溶液喷到膜上。实际上整个线是由大量的均匀点组成的，例如1mm的线喷点溶液量是1ul，而这1ul是由10nl/个的点组成，即1mm线是由100点组成。即单位长度内喷点的抗体量是一定的，这在实际应用中，做定量产品是必须的，而用在做其他定性产品也可以很好的控制批间差。也可以用来点生物芯片和传感器。 AJQ3000是一个喷金头，主要是用来将胶体金溶液喷到玻璃纤维的垫子上。由于胶体金溶液很黏稠，所以要使用外部动力促使其喷下，一般用氮气瓶和空气压缩机。 解答一些反馈的问题。BJQ3000的电池阀容易堵的问题，这个阀为了控制精确度将孔径做得非常小，所以绝对是不能够用来喷金溶液，同时喷点的C、T线抗体要求喷点前使用0.45um滤器过滤或者离心1万转/10分钟，以防止大颗粒堵塞管道。 目前反馈堵阀问题的一些单位我自己去看过，基本上都是没处理造成的大颗粒堵阀，少数地方是因为环境尘埃含量太大，使管道堵了。有些人使用BJQ3000喷金溶液，刚开始是没问题的，后期就开始出现喷点断点等不良现象，因为已经被金颗粒堵住了，这个在战友“免疫学小弟”那家工厂就是这样。 2． 划膜仪器 型号有ZX1000，这个就比上面的仪器少一个数字控制运动轴了，是接触膜，用一个划头（型号：FLONTLINE1000）利用膜的毛细作用将抗体划到膜上的。喷金与上同。 其实这个机器也可以配BJQ3000喷头来定量喷点。很多人不知道。价格方面比上面那个便宜一些。 3． 卷状仪器 就是连续化大规模生产仪器了，生产速度一般1卷50m长的膜，30分钟能喷完。这个效率太高，以致很少厂家能用得上，再加上工艺方面的原因，在国内这个机器台数是个位数。 非BIODOT喷点仪器 有些地方有使用非BIODOT的国产喷点仪器，目前我看过一些都不是很好用，唯独给我印象不错的是一个滚轴式的传送喷点机器。它的特点是用滚轮传送进料，划线喷点。效率非常高，估计是现在所有平板喷点（包扩BIODOT和其他）仪器的5倍以上，废品率也不高，较进口价格低（制造人是我一个好朋友，告诉我的是成本价），很是实用。 切条机 用途：将做好的试纸长条分切成可以使用的单人份短条，一般切成宽度3-4mm/条。 1． KINIMATIC 毫无疑问这个品牌的切刀是这个行业里面的NO.1。目前最长时间的我看过用了5年都没出问题。不过现在这个牌子在国内没有代理商，也没有办法保修。 2． BIODOT CM4000 这个太多了，很多单位都有。现在有些生产公司已经开始使用国产的切刀了，毕竟经济一些。质量方面肯定是比进口差，但对公司而言，短期投入越少越好了。 3． 国产（福建产） 国内切刀有好几个产地。但通过比较后发现，福建这个工厂生产的还是比较不错。无论外观还是做工，使用起来也方便。这个产品的模仿原型是BIODOT的CM4000。 4． 滚刀 滚刀由于本身设计上还存在着许多的不足，大多数都是在短期尝试后被放弃。再说在滚刀上投入的精力太大并不划算，废品率总是居高不下。 贴膜机 用途：将NC膜、玻璃纤维、PVC板、滤纸等各部件粘合到一起。 这个只有BIODOT一家有。实用性一般。用手贴贴掉好了，没必要搞个累赘的机器。 读条机 用途：读出反应条带的颜色，并且做对应的数据图像分析。 1．通用读条机 BIODOT TSR3000 其实我个人认为这个产品很值，因为在目前的胶体金研究中，出结果是最麻烦的，每次都是以符合率来做为标准，发的文章水平档次也不高。而这个仪器可以出一份很好的数据分析说明，包括实物照片、吸光曲线图、某点数值、吸收峰面积、同批多样品叠合对比。但好象现在买去的，利用率都不高，因为软件是英文的 ：）。缺点在于只能读可见光。 2. 专用读条机 相对上面的仪器，专用读条机往往是为某个产品专门设计的仪器，如早孕试纸的定量读条机，测心梗的临床用读条机、测荧光产品的读条机。 二． 耗材 NC膜 实验开始阶段最关键的问题就是膜的选择。 技术参数主要涉及的是膜爬速？s/4cm、对抗原抗体的包被能力。表面活性剂在膜制造的时候就加入膜内了，是主要影响因数之一，各品牌间差异较大。 现在膜一共有三个品牌，Whatman& S&S, Millipore, Sartorius. 另外还有MDI印度膜和国产膜。每个品牌下面又有各种不同的型号。所以在选择上对刚入行的新手来说，非常困难。 对于刚开始做研究的客户，millipore的M135将是一个最好的选择。这个膜性能表现中性条件，现在应用在多个产品上均性能优良，最适宜作为开始研究的平台。当然也可以尝试其他膜。 但一进入生产，情况就需要做一些调整，从性价比的角度来看M135价格过贵，会导致生产成本高，利润下降。此时就需要做一些调整，建立供应商筛选流程，和多供应商替换的办法。最理想的情况是三个供应商的产品都能适用于生产，性能不发生大的变化，这是现实可行的。 建议大家采用不处理膜的工艺方式，这样容易进行替换。经常被选择的是S&S的AE99、whatman的8um、millipore的M135、sartorius的CN140。 规格一般是采用25mm*50m和20mm*50m两种常用规格。 价格是一个很敏感的因数，小批量一两卷，就没有谈价的可能和意义。中型批量一般是在100卷，大批量在500-1000，批量越大价格当然也越便宜，毕竟这是一个工业耗品。

❻ 科研人必备的实验技能

生信需要做湿实验吗？有人认为不需要，有人认为需要。做一个好的研究不仅需要大量的生信分析，还需要更多的实验验证，生信分析和实验结果往往是相互促进的。接下来，从生物实验的角度跟大家分享掌握湿实验必备的一些技能或技巧。

1.  基础知识储备

任何一个新的研究方向都离不开理论依据，查阅参考文献资料并总结是一个科研人的必备技能。启动实验的第一步当然就是实验模型的建立。

关于动物模型制作：在开始制作活体动物模型之前，查阅文献，确定制作方法，包括但不限于确定实验鼠类型、月龄、性别、给药剂量、给药方式、一次或多次给药时间、动物生存活动环境，实验鼠是否需要分笼单只饲养、给药前是否需禁水和（或）禁食等等，如果模型制作失败，请检查制作模型的过程中的每一个步骤，必要时再次查阅相关资料适当调整。

以小鼠灌胃给药为例，选用合适型号的灌胃针，抓取小鼠使其头颈部成一条直线，方便灌胃针从口角进入。针头进入小鼠的食管即可，不可过深，手法要轻柔，否则会戳伤小鼠食道或胃壁，灌胃容积一般不超过0.8毫升，最多不可超过1毫升。

2.  手术操作或取材

这一部分没什么需要特别注意的，记住两点：准备好取材所需器材，例如手术刀、组织剪、眼科剪、镊子、EP管、培养皿、75%酒精、麻醉剂和必备液体（例如4%PFA固定液）等；提前了解目标取材位置，要尽量快速地做固定、冷冻、离体孵育或其他处理，保证实验样本保存完好。

3.  明确实验目标的特征或特性

根据研究目标的不同水平选择实验类型，例如，在蛋白水平，一般选用特定染色方法显示形态或共存情况，选用Western Blot统计蛋白量表达的升高或降低；在RNA水平，一般选用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体现基因表达的上调或下调等；在离体状态，可选用模拟体液环境的孵育实验对离子通道进行干预或不做干预，探讨研究目标的产生、分泌、消耗等；利用在体实验探讨生理或病理（口服给药，腹腔注射，静脉注射，基因敲除等）情况下研究目标的变化或调控等。如果不清楚如何选择实验方法，查阅文献资料或者问前辈。

以染色为例：选择典型的染色方法很重要。明场染色相较于免疫荧光染色保存时间较长。例如HE染色（观察组织形态等），PAS染色（糖原染色，一般用来显示糖元和其它多糖物质），DAB染色（免疫组化染色，需注意显色时间），Masson染色（胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一）等，一定要根据目标特性选择不同染色方法。

4.  准备实验材料

千万不要小看实验材料的准备，在选定实验方法之后，检查实验所用到的器械和材料等是否准备完毕，确保实验材料的齐全是保证实验顺利进行的第一步，毕竟在某些争分夺秒的时间里现场准备实验材料是来不及的，而且会大大影响实验结果的准确性。

注意一些实验常用液体（例如PBS，PBST，TBS，TBST，梯度酒精，Kerb’s液等），记得检查配液时间和可回收利用液体的使用次数等，如果发现肉眼可见的性状改变，如出现沉淀、絮状物，颜色改变等，请重新配液。

以Western Blot蛋白提取为例，样本类型不同（组织样本、贴壁细胞样本、悬浮细胞样本等）选择的裂解液也不同，要根据自己的实验目的选择合适的裂解液。一般使用RIPA裂解液（主要从动物组织和动物细胞中抽取可溶性蛋白）。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。关于不同的RIPA裂解液以及其它裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液，参考如下：

另外，Western Blot蛋白转移膜也可根据实际情况选择。一般分为三种材质：NC膜，PDVF膜和尼龙膜，区别如下：

5.  把握实验时间

对于一些复杂的实验，请一定要根据实验步骤里规定的时间进行操作，不得提前或拖延。例如，染色过程中染色或脱色时间不准确，就会导致显色过深、过浅、深浅不一甚至不显色。再者，Western Blot电泳（俗称跑胶）时间一定不能提前结束或延迟结束，让蛋白跑得太久，指定离家出走，跑的时间太短又达不到分离蛋白的目的（可以根据溴酚蓝的位置判断跑胶时间是否合适，其实跑胶时间也不是特别固定的一个数字，而是一个区间，具体与蛋白样品、仪器电压、或凝胶的质量有关哦~ 当然，如果配胶过程出现问题，就可能导致胶体本身不凝，或漏液后凝胶量不够，导致配胶失败，这个在下一部分讲）；还有转膜过程，时间不合适的话，目标蛋白就跟你的NC膜或PVDF膜无缘啦！另外，注意合理安排自己实验的时间，注意一些总时长较久的实验，尽量早点开始做，否则要么饿肚子要么熬大夜，实验也不一定能做好，实惨。

6.  注意实验细节

切记“细节决定成败”。

以Western Blot胶体的配制为例，目前一般使用SDS-PAGE胶作为Western Blot的基础,按照说明书配液即可。在配制前的准本工作中，需注意仔细检查制胶器和玻璃板（包括长板和短板）是否完好，尽量避免玻璃板体存在较大的划痕或有角破损，充分洗净制胶器和玻璃板并晾干（可以喷洒无水乙醇加快水分蒸发），后进行胶体配制。这里分享一个配胶前的小技巧：组装好制胶器后，可以在玻璃板间隙加入一些无水乙醇，记住液面位置，计时3-5分钟，观察液面位置是否下移，判断该制胶器是否有漏液情况，否则在配胶过程中出现漏液情况是比较麻烦的，要拆了重洗哦~

胶体分为分离胶和浓缩胶（也就是通常说的下层胶和上层胶），胶体凝固的标志如下：

注意：此处分离胶上的酒精或DDW（deuteriumdepleted water）为隔绝氧气的作用（也有一部分压胶作用），必须要加，倒出后可倒置制胶器晾干或用滤纸从玻璃板间隙的一角吸干，要保证滤纸干净无杂质。图中将滤纸插入玻璃板间隙的做法个人不推荐，虽然不排除某些蛋白不受影响，但为了确保实验顺利，还是注意一些为宜。

分离胶凝固后加入浓缩胶，并立即插入梳子（对，它就叫梳子），插入梳子的过程中可以左右小幅度摆动梳子，避免浓缩胶中留有气泡。

浓缩胶凝固时间大约在40-60分钟，可观察到胶体与梳子分离，拔出梳子（或观察不到，但只要时间大概够了也可以拔出），注意要竖直向上拔出，避免左右摆动破坏凝胶，导致前功尽弃。

另外，如果Western Blot电泳时蛋白出现跑歪或条带相连的情况，可能的原因包括：（1）胶体均一度不好（一般是因为加入到玻璃板之前没有充分摇匀）；（2）胶体有气泡；（3）下层胶和上层胶的界面不平；（4）仪器的问题等。

下图为蛋白正常的样例，每一孔的蛋白各自待在自己的“跑道”位置，互不打扰：

但是如果发现根本没有条带，一定要去检查实验步骤是否有错误，去查阅文献，有可能你的目标蛋白在你的样本中根本不表达，或只有在特定条件下才表达。

关于蛋白样本提取：开始实验前问自己实验台面、液氮、器械准备好了吗？实验助手找好了吗？请尽可能快速剪碎组织，剪得尽可能碎，这样与裂解液充分接触（记得称重，根据样本重量确定加入裂解液体积），提取出来的样本才不会出现浓度过低的问题。样本数量较多时尽量要有小伙伴合作，否则第一个和最后一个样本相差时间太久，可能会导致提取效果不理想。如果只能自己提取样本的话，尽量不要一次性提取太多数量的样本，避免手忙脚乱哦。切记一定根据实验步骤实施。

关于免疫荧光染色：是以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术。孵育抗体时需要避光，注意阻水圈保持闭合，避免漏液；洗完切片尽量擦去阻水圈，注意不要碰到组织切片，否则可能前功尽弃。吸取封片甘油量根据组织切片大小适当调整，放盖玻片时注意不要留有气泡等等。封片完成之后请立即拍片，如果时间不允许，可避光4℃暂放（最好不超过24小时，如果存放2-3天的经历，拍出来的效果可能不尽人意），放太久荧光会逐渐淬灭的。

另外，免疫荧光染色一般可选择染1种（下图绿色UEA-1，DAPI染胞核不计入抗原种数）或2种抗原抗体结合物（绿色TIR和红色MUC2，黄色视为二者共存），也可染3种及以上，但是要根据激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laserscanning microscope）是否可以显示相应颜色来决定，一般染2种就可以了。

如果加入多于1种的抗体，那么请注意区分两种抗体的来源应与样本来源各不相同（例如，小鼠的结肠组织，不能使用小鼠来源的抗体，可以使用兔来源、驴来源或其他物种来源的抗体）。

7.  要有 准备意识 做到心中有数

有些实验试剂需要现用现配，也就是说我们不能把所有材料都准备好再做实验，需要在实验间隙准备一些材料。那么作为实验新手，可能会出现下一步所需要的东西来不及准备的情况。这就需要我们在实验过程中有意识地去思考接下来的实验步骤，做到心中有数，才不会出现手忙脚乱的情况。

8.  注意科学性原则

无论哪一种实验，都应遵循实验的科学性，不可人为改变实验结果。当实验结果与实验假设不一致时，应遵循事物的客观规律。有些结果可能由于实验操作过程出现一些问题导致其本身就是错误的，应多次实验进行验证。当然，由于个体差异，某些实验数据会偏低或偏高，可以排除差异较大的个体，但是不可以纯粹为了验证假设，而有倾向地选取靠近假设的数据进行统计，这是违背科学性原则的。

9.  及时书写实验记录

很多时候实验结果不好的原因往往可以从实验记录中找到蛛丝马迹，但它却是经常被忽略的。实验记录的书写应该做到及时、真实、准确、完整地记录实验名称、实验目的、实验材料（包括实验试剂及配制方法、仪器、样本等）、实验过程和实验结果、出现的问题（应分析可能原因及解决办法）和实验小结（简要总结实验结果和解释，有助于指导后续研究）。每次实验还应该记录实验参与人、实验的日期和时间、以及实验条件（包括温度、湿度等）。因此一定要按时及时地书写实验记录，以便在实验过程中追溯实验原始数据并随时查阅。

10.  放平心态 保持乐观

做科研不是一簇而就的事情，不要期望只做一次实验就验证了假设或得到满意的结果。前期可能会出现各种各样的问题，这是通向科研本身的必经之路，没有捷径可言，而且要保证实验结果的可重复性，也必须多重复几次，夯实实验结论，最终的理论才更具说服力。保持一个乐观的心态做实验是我们一直需要修炼的技能，实验虐我千百遍，我待实验如初恋。当然，有些实验是就算重复N多次也不会有什么令人满意的结果的，因为可能一开始的方向就是错的。这就需要我们从知识储备开始，立论假设就要严谨、认真且全面，一定是阅读了大量参考文献和资料之后得出的研究方向和假设，要有立题依据，可以说查阅文献资料在整个做实验阶段是贯穿始终的。

各个实验都有或简单或复杂的步骤和技巧，但是核心原则和思想是相通的，以上分享的部分湿实验中所需要注意的一些细节和技巧，希望对生信分析过程中需要学习湿实验进行验证的小伙伴有所帮助。

(文中，侵删）

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❼ dot是什么意思

dot指的是美国交通部规定的安全标准，我们不妨了解一下。下面是我给大家整理的dot是什么意思，供大家参阅!

dot是什么意思

“DOT”表示此轮胎符合美国交通部(U.S. Department of Transportation, DOT)规定的安全标准。“DOT”后面紧挨着的11位数字及字母则表示此轮胎的识别号码或序列号。 DOT分为ABC三级，其中C级标准最低，仅达到了美国运输部(DOT)规定的最低性能条件。其他两级均高于DOT要求的标准。

dot网络游戏用语

DOT，即Damage over time，是一种施放于目标后在一段时间内持续对目标造成伤害的技能.

例如(魔兽世界)：

术士的“痛苦灾祸”、牧师的“暗言术·痛”、圣骑士的“奉献”、猎人的“毒蛇钉刺”等。

与其对应的是HOT，即Heal over time，是一种施放于目标后一段时间内持续对目标造成治疗的技能.

例如(魔兽世界)：

牧师的“恢复”等。

dot刹车油

DOT最低沸点标准数据 刹车油种类

(醇基) 干沸点 DOT3 205 °C DOT4 230°C DOT5.1 ~270 °C

湿沸点 DOT3 140 °C DOT4 155°C DOT5.1 ~190 °C

测试标准注解： 1、干沸点指刚从密封容器中加入刹车系统后的沸点;

2、湿沸点是指经过2年使用后含水3.5%的沸点

建议更换刹车油的条件：

绝对标准：沸点抵于180°C就必须更换——LUCAS提供一个货号为YWB 211的brake fluid boiling point tester刹车油沸点测试器

一般标准：一般汽车厂家的维修资料都建议2年更换 除非你进行沸点测试，否则很难说绝对的更换时机，比如将车轮没入水中刹车分泵完全在水中浸泡，即使密闭良好的刹车系统，全新的醇基刹车油7天后含水量就会超过3%，35天后含水就高达7%! 所以汽车厂家的更换标准之外，还要看你的使用环境，如果是刹车油才用了1年碰上水淹车，我想为安全起见，都得马上换刹车油

DOT5.1可以显著增加更换周期，一般正常平均更换周期可以到5年左右，由于使用的MTG硼酸酯和DOT4的基本相同，因此可以兼容DOT4，(个人认为叫SUPER DOT4更合适。和DOT5完全是两种材质，容易混淆)，目前主要用于赛车、军用车辆上

dot扩散光学

DOT——diffuse optical tomography：扩散光学层析成像

DOT俗称光CT，是生物医学光子成像技术的一种，利用扩散光在组织中的相对穿透深度实现器官级(5~10cm)的临床诊断用层析成像，提供了基于组织体重要生化成分的无创功能检测新模式。DOT和OCT一起构成了目前新兴的生物医学光子学中最具挑战性的研究课题和下一代医学成像模态的研究焦点。

DOT与现有成像方法相比有如下优点：1.完全的无创检测，安全可靠。2.数据采集速度快。3.合理的空间分辨率和较高动态时间分辨率。4.直接和间接地提供同时的组织体解剖和生理功能信息。5.对目标运动的稳健性、便携性和低价格。

目前对DOT的应用研究主要集中在以下几方面：

光学乳腺成像技术——乳腺肿瘤的早期诊断。

新生儿大脑发育过程供氧状况及血氧动力学观测。

脑功能成像。

光动力疗法反应信息获取。

dot(ELISA)

斑点ELISA(Dot-ELISA)是在常规ELISA方法的基础上发展起来的，1982年Hawks等及Herbrind等以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体几乎同时建立了Dot-ELISA检测法，保留了常规ELISA特异、敏感、经济、快速、可自动化等优点，而且NC膜具有更好的吸附能力(可100%吸附)，用离子型去污剂裂解的抗原也能很好地吸附，从而使该方法迅速得到推广，被认为是传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一。以硝酸纤维膜(NC膜)代替聚苯乙烯板，在膜上滴加抗原或抗体，封闭后，按常规ELISA实验操作，最后用不溶性底物显色，一般是二氨基邻苯胺(DAB)，其氧化产物为不溶的棕色产物，根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量。斑点ELISA方法具有以下优点：特异性强，假阳性少;由于NC膜对蛋白质的吸附能力优于聚苯乙烯，故其敏感性比常规ELISA高6-8倍;试剂用量少，比常规ELISA至少节约10倍;抗原膜保存期长，-20℃可保存半年;检测结果可长期保存;操作简便，不需特殊仪器(酶联检测仪)。此法简易快速，便于推广，目前已广泛用于多种寄生虫病的诊断和监测，如弓形虫病、包虫病、囊虫病、捻转血矛线虫病、血吸虫病、华枝睾吸虫病、旋毛虫病等抗原或抗体的检测。

ELISA：酶联免疫吸附剂测定

❽ Western blot实验需要准备什么试剂和耗材

1.1细胞

①将细胞培养皿置于冰上，用冰冷得PBS洗涤细胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧云天P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

b.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）

③用刮刀刮下贴壁细胞，转移至EP管，14000rpm离心5分钟

④将上清液转移至EP管，负20℃保存

1.2组织

①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）

②加入裂解液

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果组织样品本身细小，可适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分

（每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同）

③充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清

2. 蛋白定量（Thermo UF289356)

2.1稀释白蛋白(BSA)标准液的制备

2.2 制备BCA工作液（A液：B液=50：1 密闭室温可以保存一段时间）

总体积=（#标准孔+#未知孔）*#复孔*每个样本的体积

测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。

2.3 浓度测定

①将25ul标准液和样本设置复孔加入96孔板，按照样本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果样本有限就加10ul比例用1：20；推荐每个待测的样本做2-3个平行反应；根据样品的浓度，可提前稀释5-10倍)

②最好摇匀30秒，将96孔板在37℃孵育30min

③冷却至室温，酶标仪设置为562nm，在5分钟内测试完所有的样本。

④所有的样本减去空白对照在562nm处的吸光度，绘制标准曲线，确定样本的浓度

3. 蛋白电泳

3.1 变性以及还原蛋白

在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸。

3.1.1室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合。

3.1.2 100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白

3.1.3 冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可

3.1.4通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近则可以停止电泳

4. SDS-PAGE凝胶电泳

4.1 胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）

4.2 配胶（碧云天P0012AC）

洗干净玻璃板，装板加水验漏后，晾干装到制胶架上。根据配方配胶。

（配胶顺序：先配分离胶（下层胶），充分凝固后，再配浓缩胶（上层胶））

4.2.2 配制浓缩胶（上层胶）

4.2.3 组装制胶器

①将制备好的分离胶灌入制胶板内（缓慢不要有气泡），随后缓慢加入适量异丙醇压平分离胶。

②20-30分钟分离胶凝聚完成，倾斜板，倒掉异丙醇，吸水纸吸去残余液体，弃去上层压胶的水或醇。

③加入配好的浓缩胶灌入制胶板内，然后插上梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝聚。

④缓慢取出梳子，上样。

4.2.4 上样及电泳

①蛋白冰上溶解，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶板，放入电泳槽

②两块板之间倒入电泳液，确认无漏液

③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹孔使碎片冲出

④依次加入蛋白marker和蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。（上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）

⑤调节电泳的电压和时间，传统胶是上层胶80V，30min;下层胶120V 90-120min.

(为了防止蛋白条带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)

5. 转膜

将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白条带容易子啊凝胶中扩散，而且抗体也不易于进入凝胶中与目的蛋白结合，所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭、洗涤，显色等实验操作。

5.1 转膜

①将减好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作

②装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）

黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。