用什么仪器进行酶切

❶ 酶切的步骤

一、实验材料准备
1. 材料：质粒DNA。
2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。
3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。
二、单酶切 1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。（2）限制性内切酶：1 μL（约10 U）。（3）10×buffer：2 μL。（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。3. 37℃水浴1-3 h。4. 70℃水浴10 min中止反应。5. 电泳检测酶切效果。
三、双酶切 1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。（2）限制性内切酶1：1 μL（约10 U）。（3）限制性内切酶2：1 μL（约10 U）（3）10×buffer：1或2 μL。（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。3. 37℃水浴1-3 h。4. 70℃水浴10 min中止反应。5. 电泳检测酶切效果。四、结果与分析 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。

❷ 常用的酶切有哪些方法

常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。（1）单酶切法：这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n+1个DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。

（2）双酶切法：这是用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种DNA分子的方法。DNA分子无论是环状DNA分子，还是线形DNA片段，酶切结果，DNA片段的两个黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。环状DNA分子完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和。线形DNA片段完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和加1。

（3）部分酶切：部分酶切指选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切。导致部分酶切的原因有底物DNA的纯度低、识别序列的甲基化、酶用量不足、反应时间不够以及反应缓冲液和温度不适宜等。部分酶切会影响需要的DNA片段的得率。但是从另一方面说，有时根据重组DNA的需要，还专门创造部分酶切的条件，以获得需要的DNA片段。

图4-2：DNA酶切电泳图

❸ 如何给一段序列增加一个酶切位点。

你可以设计带有酶切位点的引物，对目的基因进行PCR，就可在目的基因上引入酶切位点。
步骤：引物设计（借助软件）——合成引物（公司合成）——PCR。
最重要的一个仪器就是PCR仪了，具体的加什么试剂，加多少，我想楼主应该是做分子生物学，这些应该挺清楚的了。

楼主，引物一般是用软件设计，例如Primer.5，你根据你的目的基因两端的特点，设计合适的引物，然后在引物上再添加酶切位点 ，例如EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下： 5' G↓AATTC 3' 3' CTTAA↑G 5' ，你就可以在这两条引物上分别添加这几个脱氧核苷酸，这不就在引物中引入酶切位点了吗？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了。楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点。

❹ 谁做过酶切质粒的实验啊，制感受态细胞然后转化呢求详细过程及注意要点！

大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素
1、 感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，
使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化
实验目的
1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法
感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
影响转化率的因素
细胞生长状态和密度。
转化的质粒 DNA 的质量和浓度。
试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验仪器 离心设备
实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒
实验步骤
菌株活化:
1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时
3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4感受态细胞制备:
4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min
5.4000rpm离心5min,弃上清
6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min
7.4000rpm离心5 min,弃上清
8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
外源DNA的转化:
9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min
10.于42℃水浴90S
11.冰上放置2min
12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时
13.将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上
14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
对照组
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
转化率统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

❺ 用什么酶切蛋白,可以得到大分子肽段怎样能查到酶的酶切位点、酶切过程等

如果蛋白序列已知的话,用软件如DNASTAR之类的都能进行蛋白酶模拟.一些在线工具如peptidecut也能使用.
不过这个是针对一级结构而言的,实际溶液中蛋白是折叠的,蛋白酶切位点很多都被掩埋,所以酶切预测不是很准确.至于酶切过程,这个机制到现在也只是一种假说.

❻ 在测序前如何进行pcr产物的酶切纯化，注意我想知道的是用于测序的pcr产物酶切纯化，不是用于克隆的酶切。

这种方法有比较大的局限性，要求pcr产物条带要单一，如果有杂带的话测序结果肯定就是一堆的套峰了。
这种方法是采用虾碱酶（SAP，Shrimp Alkaline Phosphatase）和外切酶I的混合溶液，来消化pcr扩增体系中多余的dNTPs和引物，以便后面的测序。一般使用的终浓度为1ul混合溶液中，含有虾碱酶0.6单位，外切酶I1.2个单位，这个比例也可以自己通过试验来调整。
一般是1ulpcr产物加2ul溶液。37度孵育15分钟，即可除去多余的引物以及dNTPs，然后80度，15分钟就可以使虾碱酶失活。
这个方法的优点是简单、快速、省钱、不损失样品，缺点是对样品要求高，如果一次纯化测序结果不好还要重来，费时费力。所以现在测序公司一般都是使用胶回收试剂盒来纯化，这样虽然工作量比较大，费钱，但基本可以保证一次成功，总体看来还是省时省力的。

❼ 各位好！~~ 请问基因工程的仪器设备有哪些越详细越好，谢谢！~~

首先，为了得到所需要的基因，需要提纯目的RNA，需要的东西除了试剂盒以外，需要离心机，移液器，还要紫外分光光度仪来测浓度和纯度。
得到RNA后，需要反转录为cDNA，然后扩增，需要PCR仪。检查PCR的结果，需要电泳和显像仪（紫外线或者荧光）

然后是酶切，分离，PCR仪和电泳仪，离心机

转染细菌：水浴箱，孵箱，培养盘

扩增细菌：烧瓶，摇床孵箱

保存菌种的-80°冰箱，保存质粒的-20°冰箱

转染，培养细胞：电转染器，或者化学法（水浴箱）。二氧化碳孵箱

❽ 提完质粒后,可以进行PCR检测也可以进行酶切检测在什么时候进行的个有什么作用

一般先跑琼脂糖电泳检测是否提出了高质量的质粒,然后通过PCR检测所提的质粒是否是目的质粒.
PCR检测指用特异引物对目的DNA进行PCR,根据产物判断
DNA是否含有目标序列.酶切检测则是通过对目的DNA上已知酶切位点的酶切,根据产物片断的大小是否与预期一致判断目标DNA是否符合要求

❾ 如何给一段序列增加一个酶切位点。

你可以设计带有酶切位点的引物，对目的基因进行PCR，就可在目的基因上引入酶切位点。
步骤：引物设计（借助软件）——合成引物（公司合成）——PCR。
最重要的一个仪器就是PCR仪了，具体的加什么试剂，加多少，我想楼主应该是做分子生物学，这些应该挺清楚的了。
楼主，引物一般是用软件设计，例如Primer.5，你根据你的目的基因两端的特点，设计合适的引物，然后在引物上再添加酶切位点
，例如EcoRⅠ
是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
5'
G↓AATTC
3'
3'
CTTAA↑G
5'
，你就可以在这两条引物上分别添加这几个脱氧核苷酸，这不就在引物中引入酶切位点了吗？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了。楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点。

❿ PCR仪是个什么仪器

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。