pcr仪器有哪些需要注意的问题

❶ PCR仪器的使用方法

1目的 </B>保证GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪的正常使用。 2 该SOP变动程序 </B>本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室技术负责人，由季度组长会议决定。如通过则公布实行。 3 适用范围 </B>GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪。 4 使用方法 </B>⑴依次打开电脑显示器和电脑主机电源开关，进入Windows 2000界面。 ⑵接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。 ⑶按需要在电脑上设定一个新的运行版面和程序。 ⑷推开滑门，将样品放入样品槽内，关上仪器滑门。 ⑸运行程序，在反应结束后按Save键储存实验结果。 ⑹关闭PCR仪电源开关。 ⑺分析实验结果；发放临床报告。 5 注意事项 </B>⑴仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。 ⑵环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右。 ⑶仪器应配备功率≥3000W的稳压器。 ⑷仪器应定期清洁维护。 ⑸仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。 6 维护方法 </B>6.1微软Windows 2000操作系统的维护 </B>硬盘驱动器每月29日运行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。现以Norton为例： ①放入Norton Utilities光盘，运行安装（Setup）文件。 ②安装完后取出Norton Utilities光盘，重新启动计算机 ③运行Norton Utilities软件，并启动其清理碎片/优化程序。 ④运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。 ⑤以后每次运行Norton Utilities软件中的清理碎片/优化程序就行了。 6.2 7000 PCR扩增仪的维护 </B>1.样品槽的清洁 样品槽每月29日进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。 操作方法： ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。 ②从样品槽移去样品架。 ③在样品槽中加入少量95％乙醇，用棉签擦洗反应孔。 ④用干棉签吸干乙醇。 ⑤向里推动滑门，锁住，使样品槽升温到50℃，以蒸发掉多余的乙醇。 2.热盖的清洁 热盖每月29日进行一次清洁，如有需要随时进行。 ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。关闭仪器，等待10分钟。 ②逆时针旋转GeneAmp 7000光源检测器顶部旋钮。向后推GeneAmp 7000光源检测器至滑轨距离的大约1/3处。 ③GeneAmp 7000光源检测器滑轨上有缺口。从这些缺口垂直抬起GeneAmp 7000光源检测器，小心侧放于仪器顶盖上。不要从仪器取走热盖。 ④用湿润的镜头纸清洁加热盖，待干。 ⑤将GeneAmp 7000光源检测器重新安装回滑轨。 6.3 GeneAmp 7000光路系统的维护 </B>1.调准ROI参照条 调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ④积分时间从512ms开始，用位置调整点，调节ROI的高度与右边线。 ⑤逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）。 ⑥调整最左侧位置调整点。 ⑦减少积分时间到1024ms，调整上方与底部的位置调整点。 ⑧减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约512ms），调节最右侧位置调整点。如有需要用右上角拖动点调整图象的倾斜度（以左上角为中心旋转）。 ⑨调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。 2.校正ROI光路 ROI光路校正每月29日进行一次，以便确信结果仍然是优化的。 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ④点选Show ROI复选框。每个样品孔周围出现一蓝色椭圆圈。 ⑤点选Show Saturation复选框。 ⑥设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。 ⑦点击LIVE按钮获取图象，然后在任何地方左击停止。获取中等程度未饱和图象（无红色图象）。 ⑧从Edit菜单中选择Calibrate ROIs每个孔都会选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。 ⑨图象太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。 ⑩检查孔ROI位置，所有孔信息都应包含在96个ROI椭圆圈中。如果没有，重复8和9步。 3.检查样品槽的荧光污染 检查样品槽的荧光污染每月29日进行一次，如有需要随时进行。 ①开启GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪电源。 ②从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。 ③从样品槽中移去反应板。GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。 ④单击New Document建立一个新的GeneAmp 7000文件 ⑤点击instrument中的catibrate显示ROI inspector窗口 ⑥把Exposure Time调到最大，把Capture image From调到最敏感的FiterB点,单击Snapshot获取图象。 ⑦减少积分时间，改变Capture image From中的A，B，C，D单击Snapshot 观察96孔中背景荧光。如孔有显著荧光则表示该孔存在荧光污染。 ⑧按照样品槽的清洁程序清洗样品槽。 4.更换卤素灯 仪器使用大约2000小时后应更换卤素灯。 ①关闭仪器，冷却15分钟。 ②将样品板放入仪器样品槽，关闭滑门。在仪器的顶部向上打开灯舱门。 ③拧下固定灯罩的螺丝，将灯罩向前滑移，使其从设备上取下。 ④将旧灯泡向前滑移，使其从夹状支架上取下，并将灯泡从灯座上拔下。 ⑤把新灯泡尾部的插杆插入灯座上的插孔，使二者连接起来。 ⑥使灯的长轴与仪器前向平行（即竖直于地面），将新灯泡滑回灯位。 ⑦在灯舱门处于打开状态下，打开仪器，确证在仪器运行时灯也能打开。 ⑧盖上灯罩，拧紧螺丝，关上灯舱门。 ⑨若新卤素灯不工作，GeneAmp 7000电源保险丝可能有问题。 7 校准 </B>GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师进行。除与仪器厂家达成协议定期校准以外，以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。 ⑴通过对室内质控图的分析，我们可以及时发现系统误差的出现。经过分析排除了试剂和人员误差后，应怀疑是否仪器出现了检测偏差需要校准。此时进行仪器状态效验实验确定是否需要进行仪器校准。 ⑵仪器状态效验试验 ①使用标准化试剂作为效验试剂。 ②在仪器处于校准状态下，由固定人员用标准化试剂对102、103、104、106标准品进行扩增实验。该实验在两个月内应进行20次。分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。 ③每年6月、12月由固定人员进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和102标准品是否检出。 ④当102标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。如结果依然，联系厂家立即进行仪器校准。 ⑤当仅有102标准品未检出时，检查实验全过程。再次上机检测102标准品 两枚。仍未检出联系厂家进行仪器校准。 ⑥仪器经过校准后，重复该实验。结果归入仪器档案。标本前处理标准操作程序 </B>1 目的 </B>保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。 2 该SOP变动程序 </B>本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室负责人决定。如通过则公布实行。 3 适用待处理标本范围 临床基因扩增实验室现行检测项目。 4 标准操作程序 4.1 DNA血清类（例如HBV） </B>⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出1.5ml离心管，对应标本编号，置于离心管架上。 ⑶将移液器调到50�0�8l，先吸取50�0�8lDNA提取液加入到编好号的离心管中。然后吸取50�0�8l血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。处理全部标本，然后将离心管插到水浴板上，用镊子放入水浴锅，沸水浴10分钟。 ⑷水浴完成后用镊子将水浴板取出，转至4℃静置8～12小时，然后10000转 5分钟离心，取上清液2�0�8l点样上机。 ⑸收拾台面至准备状态。 4.2 RNA血清类（例如HCV） </B>⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。 ⑶先用5～40�0�8l的移液器，吸取10�0�8lRNA提取液A加入到编好号的离心管中，再用40～200�0�8l的移液器吸取50�0�8l 血清加入，最后用200～1000 �0�8l移液器加入200 �0�8lRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，冰上放置5分钟，然后6000转1分钟离心。 ⑷去上清，留沉淀。加入450�0�8l 用DEPC水配制的75%的预冷乙醇洗涤沉淀，然后6000转1分钟离心，去上清。相同方法再洗一次，吸干上清，65℃10分钟烘干。 ⑸给烘干的沉淀中加入18 �0�8l的反应液I，混匀，再加入2 �0�8l逆转录酶，充分混匀，瞬时离心（3秒），放入温箱，37℃45分钟逆转录。 ⑹逆转录后95℃3分钟高温灭活，瞬时离心（3秒），取5 �0�8l上清立即点样上机。 ⑺收拾台面至准备状态。 4.3 分泌物类（例如CT） </B>⑴双手带上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次对应编号，收起验单，弃去手套。 ⑵双手换上新手套，用镊子（夹取灭菌物品专用）取出1.5ml离心管，对应标本编号后，置于离心管架上。 ⑶用镊子拧下全部试管盖并依次置于实验台面上，试管对应放置于试管架上。 ⑷向每只试管中缓慢加入1ml无菌生理盐水。 ⑸用左手取试管于旋涡振荡器上充分振荡。 ⑹将试管中的洗脱液全部转至相应离心管。 ⑺将试管和离心管分别放回试管架和离心管盒中前一排对应位置，并用镊子将管盖对号盖回，把试管架放回冰箱。 ⑻双手换上新手套，用左手将离心管全部配平，按顺序置于离心机中相应位置，以 12000转离心5分钟。去上清，沉淀再加1ml生理盐水打匀，15000 rpm离心5分钟。（如超过12管，则需分批进行）。 ⑼离心完毕后，左手取出离心管，倾倒上液，再瞬时离心，右手取移液器将管内残液吸尽，只留下沉淀。如无明显肉眼可见沉淀，则可在管内留下约50�0�8l液体。 ⑽依次向管中各加入50�0�8lDNA提取液，此时移液器应与管壁约成30度角，吸头抵至沉淀上方靠管壁处，来回抽吸，将沉淀与DNA提取液混匀。 ⑾将加入DNA提取液的标本沸水浴10分钟。 ⑿将沸水浴后的标本放置至室温，并将其放入4℃冰箱中6～8小时保证充分裂解。 ⒀离心标本10000 转5分钟。 ⒁换上新手套，取上清液2�0�8l点样上机。 ⒂收拾台面至准备状态。 4.4痰液类（例如TB） </B>⑴取晨痰加入4倍体积4％氢氧化钠待其充分液化(30分钟)，液化过程中，振荡2～3次，如痰液粘稠，可延长液化时间。 ⑵取1 ml消化液加入离心管，10000转离心5分钟 ⑶弃上清留沉淀，加入1ml生理盐水洗涤，10000 转 5分钟离心。 ⑷重复⑶操作，留沉淀，加入50�0�8lDNA提取液，混匀。 ⑸沸水浴10分钟，4℃放置8～12小时。 ⑹10000 转5分钟离心，取上清2�0�8l点样上机。

❷ PCR操作注意细节有哪些

实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。
(2)使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(3)避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
(5)最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。
(6)操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(7)尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。
(8)重复实验，验证结果，慎下结论。

❸ RT-PCR实验操作的注意事项

在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。

真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。

所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。

1．RNA的提取

RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1．1 分离高质量RNA

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。

1．2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制剂

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作

*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

1．5 RNA提取的一般步骤

RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA

破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°C的环境下。

2．RT-PCR

RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。

2．1 RT-PCR的原理

RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

2．2 RT-PCR的步骤

⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去离子水5uL，混匀，离心3-5秒；

⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；

⑶加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1uL，dNTP 2uL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；

⑷37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT反转录酶，混匀；

⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；

⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。

2．3 RT-PCR的引物设计

RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：

* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

2．4 引物退火温度

引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm 5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2．5 提高逆转录保温温度

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。

2．6 促进逆转录的添加剂

包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。

在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。

使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶：逆转录酶催化RNA转化成cDNA，不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。RNaseH-的MMLV逆转录酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全长。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。RNaseH-的逆转录酶可以显著提高长RT-PCR产物的产量，同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。

2．7 RNaseH处理

在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。

2．8 小量RNA检测方法的提高

当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。

2．9 一步法同两步法RT-PCR的比较

两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。

2．10 增加RT-PCR特异性

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。

随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。

基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。

2．11 提高逆转录保温温度

为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而某些特别的逆转录酶可以在50℃或更高进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。

2．12 减少基因组DNA污染

RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。

为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

❹ pcr需要注意的问题

1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

2、假阴性，不出现扩增条带

模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

3、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

5、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

❺ PCR实验过程中的注意事项

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失.
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究.
酶切分析：
根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究. 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法. Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研. 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析. 氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套；
2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底.若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器.如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验,验证结果,慎下结论.

❻ 实时荧光定量PCR注意事项

1. 按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2. 应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document。
3. 良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：
电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风：仪器的通风应该没有阻挡。
温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。
湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。
空间：易于操作，安全。
4. 怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染
一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。
清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。 吹打数次。 将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反应孔中的残留液体蒸发完。

❼ 在做pcr的操作过程中需注意哪些问题

首先，在设计PCR引物时，结构要好，长度应在20bp左右，避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致，最好是在55度左右。
其次，使用的DNA模板量是比较关键的，应使用纯度较高，基因组较完全，没有产生断链的基因组DNA。
然后是PCR体系中各个试剂的使用，比如说酶的纯度，活性，并且要注意酶量一定要适中，过尤不及。各DNTP的量要保持一致。PCRbuffer中要注意有无添加镁离子等帮助反应进行的东西。等等。
最后是PCR程序的设置。如果怕一开始就使用一个固定的退火温度扩增不出来，可以先小批量得试验温度梯度，或者用touchdown程序，即先设置一个较高的退火温度，这样引物的特异性结合会比较好，然后每个循环的退火温度都比上个循环低0.5度或1度，最终停留在某一个较合适的温度完成整个程序。
PCR反应中有太多细节要注意了。只能在试验中摸索，进步。
现在也有公司可以代做PCR，省时省力，大大缩短研究周期。
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❽ PCR实验操作注意事项有哪些

1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室。

2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求

荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证。

4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。

5、必须在无菌无尘环境下进行操作PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。

(8)pcr仪器有哪些需要注意的问题扩展阅读

PCR实验的应用价值：

能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗。

人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。

❾ 规范化的pcr实验室应注意哪些

1、建立样品准备区
这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、建立前PCR区。
该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作。
⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物。
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法。
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。
7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动

❿ 我想问做PCR扩增应该注意的事项

注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
1． Chloroform：氯仿 (分析纯)
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 关于Trizol Reagent的使用过程：
1． Homogenization（匀浆）
a. Tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b. Cells Grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）
针对JEV细胞总RNA的抽提法：
BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。出 现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两 种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）
（1） 组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3） 4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4） 仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6） 4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。
（8） 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分离组织10mg（纯组织）加800ul Trizol试剂。
（10） 扩增产物的鉴定
DEPC处理方法如下：
1. DEPC处理
（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的.
如何消除污染
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2）加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目 前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA定量
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏，最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度 的影响
RT-PCR有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达 量，不是绝对表达量
mRNA的分离与纯化中
步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3）保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染与对策
)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
1标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度
反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。
2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。