病毒的外形是用什么仪器确定的

㈠ 1. 病毒的尺寸只有100纳米左右,你知道用什么仪器可以测量其尺寸吗其基本测量

1. 病毒的尺寸只有100纳米左右,你知道用什么仪器可以测量其尺寸吗?其基本测量1. 病毒的尺寸只有100纳米左右,你知道用什么仪器可以测量其尺寸吗?其基本测量1. 病毒的尺寸只有100纳米左右,你知道用什么仪器可以测量其尺寸吗?其基本测量

㈡ 病毒是什么样子的

人们在电镜下观察到许多病毒粒体的形态和大小，病毒的形态同其壳体的基本结构有着紧密的联系。病毒的形态主要有以下几种：①球状病毒；②杆状病毒；③砖形病毒；④冠状病毒；⑤有包膜的球状病毒；⑥具有球状头部的病毒；⑦封于包涵体内的昆虫病毒。

病毒粒的对称体制：病毒粒的对称体制只有2种，即螺旋对称（代表：烟草花叶病毒）和二十面体对称(等轴对称，代表：腺病毒）。一些结构较复杂的病毒，实质上是上述2种对称相结合的结果，故称作复合对称（代表：T偶数噬菌体）。

病毒主要由核酸和蛋白质外壳组成。由于病毒是一类非细胞生物体，故单个病毒个体不能称作“单细胞”，这样就产生了病毒粒或病毒体病毒粒，有时也称病毒颗粒或病毒粒子，专指成熟的结构完整的和有感染性的单个病毒。核酸位于它的中心，称为核心或基因组；蛋白质包围在核心周围，形成了衣壳。衣壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分，有保护核酸等作用。衣壳是由许多在电镜下可辨别的形态学亚单位——衣壳粒所构成。核心和衣壳合称核心壳。有些较复杂的病毒（一般为动物病毒，如流感病毒），其核心壳外还被一层含蛋白质或糖蛋白的类脂双层膜覆盖着，这层膜称为包膜。包膜中的类脂来自宿主细胞膜。有的包膜上还长有刺突等附属物。包膜的有无及其性质与该病毒的宿主专一性和侵入等功能有关。昆虫病毒中有一类多角体病毒，其核壳被蛋白晶体所包被，形成多角形包涵体。

病毒的复制过程叫做复制周期。其大致可分为连续的5个阶段：吸附、侵入、增殖、成熟（装配）、裂解（释放）。

㈢ 观察病毒的形态结构通常要使用的仪器是（）A．放大镜B．低倍光学微镜C．电子显微镜D．高倍光学显微

病毒是一类形体十分微小的生物，形体比细胞小得多，只能用纳米来表示．大约10亿个细菌等于一颗小米粒大，大约3万个病毒等于一个细菌大，一个病毒的大小约为10～300纳米，（1纳米=一百万分之一毫米），普通光学显微镜是观察不到病毒的，电子显微镜放大倍数比光学显微镜高许多，可以达到几十万倍．所以只有借助于电子显微镜才能看清楚它的形态，形态多种多样，大体有球形、杆形、蝌蚪形；病毒没有细胞结构，身体由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成．
故选：C

㈣ 证实病原体是病毒后，要用到何种仪器才能看到其真面目而便于分类/

病毒分离后，电子显微镜观察！

㈤ 我们观察病毒，应选用的仪器是（）A．放大镜B．光学显微镜C．电子显微镜D．解剖显微

病毒是一类比细菌还要小的微生物，形体及其微小，放大镜和光学显微镜放大倍数太小，不能观察到病毒而解剖显微镜能形成正立像，立体感强．常常用在一些固体样本的表面观察，或是解剖、钟表制作和小电路板检查等工作上，也不能观察到病毒，通常只能借助于电子显微镜才能观察到它们．
故选C

㈥ 植物病毒检测的血清学技术都有哪些

植物病毒的外壳是一种核蛋白，在蛋白的表面带有抗原决定簇，当植物病毒进入动物体内时，即可产生与抗原相应的抗体，这种带有抗体的血清即为抗血清。相应的抗原抗体之间可产生专化性的结合，即抗体只能与其相应的抗原结合并产生一定的反应，此即血清反应。这种反应在植物体外也能进行，根据这种反应可以测定两种病毒间的关系。因而，血清学检测成为植物病毒的重要鉴定技术。常见的血清反应主要有以下几种：

中和反应：使含有植物病毒的汁液与相应抗血清中的抗体充分结合，当抗体过量时，可将所有植物病毒抗原全部吸收掉，此时因植物病毒汁液中已没有病毒粒子存在而失去侵染性。此即为中和反应，不仅可对植物病毒进行定性，还可用于定量测定。

沉淀反应：将一系列稀释度的抗原（病毒）和一系列稀释的抗体（抗血清）分别混合，在两者稀释比例适宜范围内可出现沉淀物，此即为沉淀反应。此类反应如：微量沉淀反应，琼脂双扩散反应，及免疫电泳等，都是在植物病毒检验中最常见的血清学技术。

凝集反应：把病毒的抗体先吸于一种与免疫无关的颗粒表面，然后使其与相应的抗原结合而出现的凝集，即为凝集反应。常用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、血细胞、A蛋白等。

抗体标记：对抗体用荧光素、酶或同位素等进行标记，然后通过对标记物的检测追踪抗原，常用的有酶联免疫吸附、荧光免疫、同位素免疫实验等，这类检测技术灵敏度极高，适于对微量抗原的检测。

现将在植物检疫中常用的几种血清学技术介绍于下。

1.微量沉淀反应

在溶有抗原的溶液内按适当比例加入抗血清时，抗原与抗体互相结合而沉淀。其方法如下：

（1）用蜡笔在培养皿底部各划8条横竖线形成方格。

（2）取两排小试验管，每排7～8个，一排用于抗原，一排用于抗血清，每试管中加0.2ml的缓冲液。

（3）制备1mg/ml纯化病毒原液，在抗原稀释排中加0.2ml原液于第一试管，用1ml的移液管再从中吸0.2ml移至第二管，然后再移0.2ml于第三管，一直移到最后一管，各管的稀释度分别为原液的1/2至1/128。

（4）在小试管中加1.5ml含0.025%防腐剂NaN3的缓冲液，在缓冲液内混入0.1ml未稀释的抗血清，制备出1/16稀释度的抗血清作为原液；在第二排的第一试管中加0.2ml的原液，混合后移0.2ml至第二管，如此一直到最后一管，制备出1/32～1/2048的稀释系列的抗血清。

（5）用微量移液管从抗血清最高稀释度（1/2048）开始，在培养皿的第七横排的每个方格滴加1滴，同样将1/1024稀释度的抗血清加到第六横排，这样将板上所有的方格均滴加各种稀释度的抗血清。

（6）用另一移液管从最稀的抗原液开始，在第七纵排每方格内滴加1滴，按同样方法在第一至第七纵排各方格内滴加各种稀释度的抗原。在所有第八横排和纵排的方格内滴一滴缓冲液做对照。随后在反应液滴上复盖一层液体石蜡油防止蒸发。

（7）将制备好的培养皿在室温湿润环境下孵育2h后，在暗室用双目解剖镜观察，然后在普通冰箱内过夜，第二天继续观察结果，此时沉淀已清晰可见。

以最浓的沉淀为四，以下逐渐减弱的梯度分别记为三、二、一，以三为抗原最大稀释度和产生沉淀的最小血清用量，作为抗原抗体最适比例

微量沉淀技术测定抗原抗体最适反应浓度表

（8）实际测定时，用最适稀释度的抗血清与其相应的抗原和异种抗原进行反应，或用最适稀释度的抗原与其相应的抗血清和异种抗血清进行反应，均可观察它们间的血清学关系。如表0-4-2所示，

微量沉淀技术测定多种抗原间血清学关系表

各供试抗原的稀释度为1.56mg/ml，与1/4至1/1024的不同稀释度的抗血清反应结果表明，第一、二、五、六、七横排的抗原与抗血清的相应抗原是相同的，第三、四两排抗原与抗血清的相应抗原虽然不同，但有一定亲缘关系，第八、十排抗原则与抗血清的相应抗原有远缘关系或无血清学关系，第九排的抗原则完全无关。

2.琼脂双扩散试验

琼脂凝胶的含水量极高，允许分子质量20万u以下的大分子物质自由通过，绝大多数的抗原和抗体分子质量都在20万u以下，在琼脂凝胶中的运动所受阻力甚小，可自由扩散，免疫双扩散就是应用这一原理，在一块琼脂凝胶板上打几个小孔，分别置入抗原及其相应抗体，抗原与抗体分别向凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度最适比例处，形成肉眼可见的抗原抗体结合物的沉淀带，带的大小形状数量和密度决定于所测试的抗原抗体的特性。本法适于检测植物粗汁液、澄清液和高度纯化的抗原。试验时需设置健康植物汁液及标准抗原作为阴性和阳性对照。本法的特点是可同时检测一种抗原对多种抗体，或一种抗体对多种抗原间的血清学关系，对病毒的鉴别极为方便。缺点是灵敏度较低，抗血清用量大，检测时间长。具体检测技术如下：

（1）称取琼脂加入适当的缓冲液中，用水浴或微波炉加热至琼脂溶解，按0.1%加叠氮化钠。置培养皿或玻璃平板于水平台面，当琼脂冷却至60℃时，倒适当量于板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。静置至凝固。

（2）将模式图置于板下，用打孔器打孔，挑除孔中琼脂，孔的排列有多种形式，常用的排列，由一个中央孔和周围六个孔组成，孔的直径7mm，周围孔与中央孔的距离为3～4mm。

（3）用缓冲液或生理食盐水在小试管中稀释抗原，在周围孔中加最适稀释度的抗原，在中央孔中加最适稀释度的抗血清。外围孔中加倍比稀释系列的抗原，中央孔加倍比稀释系列的抗血清，产生致密狭窄的沉淀线的组合为最适浓度。

（4）将培养皿在保湿环境下进行孵育，次日在暗背景下观察沉淀线出现情况。在印有排列模式团的纸上，图记沉淀线的形式，沉淀线图形可用照相或染色保留。

（5）结果的判断：根据沉淀线的形状分析抗原与抗体，及抗原互相间的关系。

对长形病毒进行琼脂双扩散检测时，可在琼凝胶介质中加入十二烷基磺酸钠（SDS），此剂为一种阳离子表面活性剂，可将病毒裂解成具有抗原活性的可扩散的片断利于检测。

3.对流免疫电泳

在以琼脂凝胶为介质的情况下，免疫球蛋白带有微弱负电荷不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极迁移，而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵消电渗后仍向正极迁移。依此设计的对流免疫电泳是将琼脂电泳与免疫沉淀相结合的方法，将抗原病毒放在琼脂凝胶靠近阴极一侧，抗体放在靠近阳极一侧，在直流电场中，抗原迁向正极，免疫球蛋白迁向负极，相遇后形成免疫沉淀线。具体技术如下：

（1）凝胶床的制备。取定量琼脂粉用蒸馏水浸泡2～3d，每日换水1～2次，用硼酸缓冲液配成1%～1.2%的琼脂液，加0.1%叠氮化钠。将玻璃放在水平台上用吸管将缓冲液琼脂注到板面，制成2mm厚的凝胶床并打孔。

（2）将制好的凝胶床放在电泳槽内，加缓冲液（用配制琼脂凝胶的缓冲液稀释1倍）离床面2～4cm，在琼脂板阴极一端孔中加入抗原，在靠阳极一端孔中加入特异性抗血清，在琼脂床的两端用两层纱布使琼脂板与电泳槽中的缓冲液相连，进行电泳。

（3）进行电泳时，电压、电流和时间，根据缓冲液离子强度、电泳床大小和抗原性质而有所不同。只要不使病毒抗原变性，尽量保持较高的电压，如电流超过2mA，电泳应在低温下进行。

（4）电泳完毕后，将电泳板放在黑色背景处观察，也可将电泳完毕的琼脂凝胶板先浸在生理食盐水中30min，然后放在苦味酸溶液中20min，可将背景染成黄色，沉淀为白色，便于观察。

免疫电泳与琼脂双扩散相比有三个优点，快速、灵敏并可用于在琼脂中扩散慢的长形病毒。

4.乳胶凝集试验及A蛋白乳胶凝集试验

用特异性抗血清提纯的免疫球蛋白，将其吸附在乳胶粒子上，制备抗体免疫球蛋白致敏乳胶。当与相应的抗原相遇时即可产生凝集反应。这是一种灵敏度高特异性强的血清学技术，但是每次都要特异性抗血清提取抗体γ球蛋白，制备手续繁杂不便应用，如直接用抗血清致敏乳胶则显著影响效果。其后Querfurth（1979）发现A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影响与相应抗原结合。这样就可先使A蛋白与乳胶粒子结合，再与抗血清中的免疫球蛋白结合，形成A蛋白-乳胶-免疫球蛋白的复合体。这种乳胶凝集试验可简化致敏免疫球蛋白的过程，而获得同样效果。具体做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳胶的制备。

将特异抗血清用33%饱和硫酸盐析法提取球蛋白，悬浮于0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）缓冲液内，取10%空白乳胶稀释15倍后与等量适宜浓度的球蛋白液混合，置室温2h后移入冰箱内过夜。经低速离心（7000r/min，20min）取沉淀悬浮于缓冲液内，经反复离心洗涤2次后将最后沉淀物悬浮于缓冲液内即可得抗体球蛋白的致敏乳胶。

（2）A蛋白乳胶致敏抗体的制备。

将市售A蛋白溶于0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸缓冲液内，制成A蛋白溶液，与等量稀释15倍的空白乳胶液混合，置室温3h，移入冰箱过夜。低速离心（7000r/min20min）后将沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液，反复离心洗涤2次，沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液制备A蛋白乳胶溶液，与等量适宜稀释度的抗血清混合，置室温下3h后移入冰箱过夜。再反复离心洗涤2次，最后将沉淀悬浮于与抗血清等等量的甘氨酸缓冲液内，即可得A蛋白乳胶致敏抗体。

（3）检测法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀释抗原，制成20、40、80、160、320、640、1280的系列浓度，在一洁净玻璃板上，用笔画好方格，每格加2滴不同稀释度的抗原，然后再加1滴乳胶致敏抗体（或A蛋白乳胶致敏抗体）用微量血液振荡器以120r/min振荡混合后，用肉眼或10～25倍解剖镜观察结果。同时设空白乳胶液和健汁液对照。

阳性反应表现有明显的絮状或颗粒状凝集物，背景清明透亮，阴性反应则仍为均匀的牛乳状液。也可用浊度计检测其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干扰较小，适于直接采自病株的澄清液，不但适合球状病毒，对杆菌状病毒，棒状病毒，线状病毒也适用，并有较高的灵敏度。但对效价低的抗血清或含有乳状胶体的植物不适用。

5.酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原或抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助标记在抗体上的酶与底物所产生的颜色，检测相应的抗原。此法灵敏度高，特异性强，快速简便极适宜植物检疫应用。常用的检测方法有以下几种：

（1）直接法。

将待测样品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板内，保温后洗涤，使附着于壁上的抗原与加入的酶标抗体γ球蛋白反应，洗涤后保留与抗原结合的酶标γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度计进行检测。

（2）间接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗体与酶结合制备酶标记抗体，将待检抗原包被于固相载体，经过孵育洗涤，加入特异性兔抗血清，孵育洗涤后加羊抗兔酶标记抗体，孵育洗涤后加入底物，观察结果。

（3）双抗体夹心法。

先将特异抗体免疫球蛋白包被于固相载体，保温洗涤后，加待测抗原，使与吸附于载体上的抗体反应，保温洗涤后再加入特异抗体的酶标记物，最后加底物观察反应结果。

（4）A蛋白酶联法。

将A蛋白用pH9.6的甘氨酸缓冲液稀释后包被微板，加入特异性抗血清，使其与已固定在微板上的A蛋白结合，再加入待测抗原使其与特异性抗体反应，再加入特异性抗体，使其与抗原反应，再加酶标记A蛋白，最后加酶的底物测其光密度值。

（5）异种动物双抗体夹心法。

先将第一抗体（兔血清抗体）包被微量反应板，加待测抗原后，加适宜浓度的第二抗体（鼠腹水抗体），再加入市售羊抗鼠酶标记物，最后加底物观察反应，一般8h即可得出结果。此法保持了双抗体夹心法快速准确灵敏度高的特点，对球状病毒、杆状病毒、线状病毒、棒状病毒均可应用。抗体不必纯化可直接使用（但未纯化的抗血清需先选择其最适工作浓度），使用市售酶标记物，可省去制备酶标记抗体的复杂手续，还可克服间接法非特异性反应干扰大的弱点。

（6）生物素抗生物素酶联法。

生物素具有很强的亲和力，是抗原抗体反应的1万倍，两者一旦结合就难以离解，且不受酸碱变性剂蛋白溶解酶及有机溶剂的影响，具有高度稳定性，生物素一经活化可与蛋白质呈偶联结合，即一个大分子可结合多个生物素分子，生物素又可大量结合在酶标记物上，使酶标记物成为多价，而抗生物素本身又是一个多价分子，每一亚基均可结合一个生物素分子，因此，这种方法可产生多级放大，使灵敏度提高10倍以上，并降低非特异性反应，把酶联免疫吸附技术又提高一步。具体方法如下：

先将第一特异抗体（兔抗体或鼠腹水抗体）包被在固相载体，加待检抗原，加第二特异性抗体（鼠腹水抗体或兔抗体），再加入相应生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶结合物，最后加入底物观察O.D.值。

（7）膜上斑点酶联法。

先用软铅笔在一张适宜大小的硝酸纤维素膜上划好边长1cm的方格网，把纤维素膜浸入TBS缓冲液漂洗30min，然后将膜放在两张滤纸之间，在室温下风干，用移液器将抗原抽提液滴在各方格中央，室温下风干，用TBS-T缓冲液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出后放在滤纸上至膜表面水滴消失，然后浸入封闭液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保温1h，取出晾干后，浸在用封闭液稀释的第一抗体溶液，在37℃下保温1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min换液一次。将膜浸入稀释度1/200的酶联球蛋白，室温保温1h，用上法洗膜后，用碱性磷酸酯酶缓冲液冲洗两次，每次10min，将膜浸入酶底物溶液内，室温下避光5～15min，显色完全后弃去底物液，用终止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜于滤纸内彻底风干后观察结果。

此法可克服塑料板的不足，只用目测就可对结果定性，不需要复杂的仪器，所需抗原抗体量均很少，灵敏度比常规酶联法高10倍以上，适合大量抗原的检测。

6.免疫电镜

电镜检测可快速确定病毒粒子的形状，是鉴定病毒不可缺少的技术，但有的样品浓度很低，用普通的电镜技术不易观察，如将病毒粒子包被后，抗体可把病毒粒子捕捉成聚集物便于观察。同时还可从病毒粒子与抗体的结合情况，观察两者间的血清学关系。通常使用的有以下几种方法：

（1）叶片浸沾血清技术。

把一滴稀释的抗血清，滴在有膜的铜网上，将叶片的新鲜切口浸入血清滴中1～2s，置于室温下5～10min，使血清与相应的病毒聚集并装饰起来，再进行负染检镜。

（2）Derrick氏法。

把火棉胶膜铜网在24℃下，置于按1∶10比例稀释于Tris缓冲液的抗血清内，然后将铜网用缓冲液冲洗后使用。把病毒的粗提液稀释于含HCl的Tris缓冲液内，将已用血清包被的铜网浮于0.1ml的病毒稀释液内1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水冲洗，然后干燥喷镀。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸缓冲液稀释到1/100的浓度，取10μl滴于载玻片，将切成2mm见方的病叶在血清滴中压碎，在湿室中保湿15min，用镊子持有膜铜网蘸取液滴，用20倍磷酸缓冲液冲洗后，再用蒸馏水洗，最后用5滴醋酸氧铀染色观察。

（4）修饰法。

取2mm见方的病叶在载玻片上的10μl蒸馏水中压碎，持有膜铜网沾此液滴，将病毒粒子吸附于铜网上，然后将铜网用20滴的磷酸缓冲液冲洗，吸去水分后加1滴稀释成1/100的抗血清，在湿室中保湿15min后，将铜网用20滴磷酸缓冲液和30滴蒸馏水冲洗，最后用醋酸氧铀染色检镜。

（5）诱捕修饰法。

先将铜网用稀释1/10或1/100的特异性抗血清包被，再把病毒样品滴于铜网，保湿15min，用缓冲液及蒸馏水冲洗吸干，再加1滴稀释成1/100的特异性抗血清，孵育15min后，用缓冲液和蒸馏水冲洗，吸干染色检镜。

（6）羊抗兔血清诱捕修饰法。

在诱捕修饰法未染色以前，再加1滴稀释1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗涤后染色镜检。此法因病毒粒子外壳包被有两层血清，明显加粗，在2000倍的低倍电镜下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白诱捕修饰法。

在福尔马膜的铜网上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育后洗去多余的A蛋白，再包被稀释100倍的特异性抗血清，滴加抗原，再滴加特异性抗血清，最后染色镜检。此法比一般诱捕修饰法灵敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

㈦ 观察病毒的形态结构通常要使用的仪器是什么

C.电子显微镜
病毒很小，属于亚显微结构，用光学显微镜观察不到

㈧ 科学家在观察流感病毒时使用的是什么显微镜

观察病毒一般需要借助电子显微镜，通常是透射电镜。
流感病毒电镜照片：www.sn.xinhuanet.com/...66.htm
另外，用X衍射技术也可以观察病毒形态。

㈨ 如何利用电镜技术测定病毒粒体的特征

随着科学的发展，电镜已成为一种综合的分析仪器，在植物病毒的诊断和鉴定中发挥着重要作用。植物病毒学上用得较多的是透射电镜。

1 透射电镜的成像原理

显微镜的分辨率与其使用光源的波长呈负相关，即波长越短分辨本领越大。可见光的波长范围为0.4～0.7μm，它决定了光镜的分辨极限为0.2μm，有效放大倍数不能超过2000倍。电镜用的光源为电子枪产生的高速电子束，其波长比可见光短十万倍以上，因而大大地提高了分辨率。电镜分辨率接近0.lnm，有效放大倍数在百万倍以上。

在电子显微镜下可观察病毒粒体外形、大小以及在寄主细胞中的位置等。植物病毒粒子常见的有球形、长杆状、线形和弹状。

2 制样技术

样品处理技术多种多样，适用于不同的材料和观察目的。如金属投影和复型技术，主要用于病毒或其他大分子的表面结构和大小观察；冰冻蚀刻用于细胞化学、生物膜等研究；另外还有放射自显影电镜技术、免疫电镜技术等。而植物病毒学上广泛应用的是负染技术和超薄切片技术。负染制样操作简单，所需时间少；而超薄切片制样方法操作复杂，所需时间长，但这种方法可以观察到病毒粒子在组织中的情况。

2.1 负染技术

负染是相对正染而言的。是指在样品的周围包被高电子密度的染料，背景呈深色，而样品呈白色，反衬出样品的轮廓。病毒负染后能很清楚地看到其大小和细微结构。此法简便、易行、快速，为病毒诊断提供了一种可靠手段。现在鉴定病毒，一般先用病汁液做负染观察，根据看到的病毒的大小和形状等，能为进一步研究提供许多有用信息，如采用什么方法提纯、病毒的分类地位如何等。其中有六个病毒属的形态特征非常典型，几乎可以凭此特征就能确定它们属于哪个病毒科、属，见表1。

表1 六个典型特征病毒属

pH调节用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而钼酸铵用醋酸铵调，甲酸铀用氢氧化铵调。

强大电子束的轰击，是造成病毒变形和失去结构细节的另一重要原因，观察时要采用尽量低亮度光斑，动作迅速，以减少轰击时间。Forvmor膜等在电子束照射下，容易漂移，这样病毒会被拉长或拉宽，因此，在测量病毒颗粒大小等精确观察时，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加喷一层碳膜。

（5）病毒粒体大小测量 目前病毒学工作者已经注意到，同一病毒的大小不一样，有些甚至相差甚远。这可能是由于不同分离物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由于实验误差或方法上的差别造成的。测量病毒大小，一般不宜提纯病毒，而要用病株粗提液。因为病毒在提纯过程中的形态结构，会由于提纯过程中离子环境等的变化和物理因素的影响发生而变化。染色要用两种以上染料，测量病毒颗粒的数量要尽量多，尤其是线状病毒容易断裂，数量应在100个以上。

2.2 超薄切片技术

根据电镜成像原理可知，用于电镜观察样品其厚度要求在数十纳米，而通常单个细胞的厚度在数十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用于光镜的切片机，其切片厚度一般在单个细胞水平，所以电镜观察必须做超薄切片。

超薄切片一般程序为：取材—固定—脱水—包埋—切片—染色—电镜观察。

（1）取材 取材要求典型、迅速，机械损伤小。材料切成1mm3大小，离体后1min之内进入固定液。应取不同寄主材料、同一寄主的不同组织和不同接种时期的样品。

（2）固定 是用物理的或化学的方法迅速将细胞杀死，并且尽可能地使保存和固定细胞内各种结构、生物大分子生活时的状态和位置。电镜中常用的固定方法是化学固定。常用四氧化锇、戊二醛、高锰酸钾或重铬酸钾等固定剂。在病毒学中一般采用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化锇（用0.2mol/LPBS，pH7.2配制）双固定法，这样细胞中的多种成分，如蛋白质、脂类、多糖、核酸等，大部分都能固定下来。戊二醛固定12～24h，四氧化锇固定2～4h。戊二醛遇到锇酸会形成沉淀，因此戊二醛固定后一定要用缓冲液充分清洗后再进行四氧化锇固定。固定在超薄切片中很关键，固定液的种类、浓度、pH、渗透压、离子组成、固定时间、温度和方式都与固定的质量密切相关。因此，整个固定过程应该在4℃下进行。固定剂一定要用缓冲液配制。固定好的材料，电镜下细胞内各种膜系统应该完整，没有断裂，双层膜要基本平行，细胞质呈精细颗粒状，没有空白。固定后缓冲液要充分清洗后再进行下面的步骤。

（3）脱水 常用的包埋剂是疏水的，因此包埋前要用既亲水又亲脂的乙醇或丙酮进行脱水。从低浓度到高浓度的脱水剂脱水，最后用绝对无水的脱水剂脱水。

（4）包埋 包埋的目的是增强样品的机械强度，使样品具有一定的机械形状，适于切片机工作；另一个重要作用是进一步固定细胞结构。包埋剂种类很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等环氧树脂。包埋过程中发生的化学反应，叫聚合过程。聚合过程中实际上发生了两类反应，一类是环氧树脂末端环氧基之间在胺类化合物（如DMP-30）催化下，化合生成长链；另一类是树脂中间的羟基和交联剂（也称固定剂）的酸酐发生反应，生成横向连桥，加固了树脂分子之间的联系。为了增强树脂聚合形成的包埋块的切割性能，常加入一些增塑剂，如树脂、催化剂、固化剂。

（5）切片 准确、熟练地掌握切片机操作技术，包埋块软硬适度，修块好，就能切出要求质量的片子来。这里技巧很重要。

（6）超薄切片的染色 也叫电镜技术的正染色。观察内容不一样，采用染色方法不同，病毒内含体和细胞病理学研究则常用醋酸双氧铀—柠檬酸铅染色法。切片在1%～2%醋酸双氧铀中染色20min，用50%乙醇冲洗后用柠檬酸铅染色30min，0.01mol/L NaOH冲洗。染色的关键是要防止醋酸铀和柠檬酸铅生成沉淀。防止污染的主要措施是防止CO2和柠檬酸铅反应。如用刚制备出的蒸馏水配制染料和冲洗剂，染色时在小室中进行，小室中放入吸收CO2的固体NaOH，防止人呼吸时CO2进入小室中，戴口罩等。染色和冲洗完毕，切片自然干燥后就可以电镜观察。

电子显微镜的出现及各种电镜技术的发展，为植物病毒的直接观察起到了巨大的推动作用，使检疫工作人员能得到受病毒感染的病毒粒子电镜照片以作为直接证据。但电镜观察结果需要和其他方法的检测结果相结合，才能确定病毒的分类地位。这是因为许多病毒都有类似的形态和结构。由于一些植物汁液中病毒浓度过低，在进行常规的电镜观察检测中，很难发现病毒粒子，这样就要求对一些植物病毒进行分离和提纯，以便进行有效的电镜观察和其他理化检测。病毒的分离和提纯主要是采用差速离心、PEG沉淀的方法，进一步的纯化则采用密度梯度离心和柱层析法。为了直接检测植物体内的带毒情况，常采用植物组织的超薄切片和电镜观察进行。超薄切片的电镜观察可以直接用于对植物组织内部的病毒形态、内含体形态、病毒所在的部位、受感染的植物组织发生的病理学变化等进行检查。