双荧光素酶报告需要什么设备

1. 荧光素酶报告基因的技术流程

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

2. 检测荧光素酶报告基因发出荧光的都有什么仪器 例如各有什么优缺点之类的

Luminex,荧光分光光度仪,荧光凝胶成像仪,液闪仪 ,荧光酶标仪,荧光显微镜
都很贵.推荐荧光酶标仪和荧光显微镜.
Luminex是液体芯片测定,同时检测30个目的蛋白,定量,灵敏.
荧光分光光度仪用途比较局限,不方便.
荧光凝胶成像仪的对象是凝胶
液闪仪和luminex很像,但是只能检测一个蛋白或靶标
荧光酶标仪就是酶标仪,但是可以检测荧光信号,同时可以测定至少96个样品的单一靶标
荧光显微镜不能定量,但非常直观,可以看到是那些细胞发光,以及发光的部位.而且可以同时看到1-3种荧光,价格比前者低些.

3. 双荧光素酶报道系统详解

一、概述

报告基因 (reporter gene):是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

  一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。

在基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如绿色荧光蛋白(GFP）和荧光素酶。

荧光素酶（Luciferase）：是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。

荧光素酶报告基因的优点

蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。

在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。

检测快速，每个样品只需几秒钟

二、实验原理

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop & Glo® 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。

三、操作程序与结果判定

A．检测前相关试剂配制

1.  1X PLB裂解缓冲液配制：将4×体积水或PBS加入1×体积5X PLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X 缓冲液，平衡需2-3 mins）。

2.  Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：将Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后，分装，置于-20℃避光保存。（一次配好，分装成小管，避免反复冻融），使用前将配好的LAR II从-20℃拿出，并平衡至室温（需20-30min）。

3.  Stop & Glo® Reagent配制：现用现配，先将Stop & Glo® Buffer放在37度温箱中平衡至室温（15-30min），再将1倍体积的50X Stop & Glo® Substrate加入49倍体积的将Stop & Glo® Buffer中。

B．样品制备

1.  仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用1XPBS漂洗细胞2-3次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用PBS吸尽（防止细胞掉落）。

2.  24 孔板每孔加入100-150μl 1X PLB裂解缓冲液以覆盖细胞，然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。

C．双荧光素酶检测方法（Promega GLOMAX） (注：系统运行时请勿触摸操作屏)

1.  重新设定系统：Tools  Settings    Reset

2.  双荧光素酶检测程序的设定：

Protocols      Run Promega Protocol      DLR-O-INJ    OK

3.  将50μl LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取10μl 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出泡），置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。（使用前LAR II要混匀，并平衡到室温）

4.  测量结束后，取出EP管，再加入50μlStop & Glo® Reagent，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出泡），再次置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强度）。（Stop &

Glo® Reagent 现配现用，不能保存）

5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光素酶反应强度, RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率，也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。

6. 测量完毕后，请将最后检测的EP管取出后，关闭仪器。

7. 实验结果的处理与分析：采用双样本等方差t检验进行处理，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

四、注意事项

1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

2. Renilla荧光素酶检测工作液需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。

3. Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反复冻融，保证每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20可稳定保存一个月，在-70℃可稳定保存一年。

4. 试剂保存和使用时都应避光。

5. 为取得最佳测定效果，测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内（1-2秒）。

6. 使用过程中切勿接触操作屏（程序会被终止或取消）。

7. 平时尽量不要移动仪器，防止触摸屏走位。

4. 双荧光素酶检测启动子和荧光定量检测启动子有什么不同

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。

二、荧光素酶报告基因的检测流程

1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；
2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；
3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；
4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；
5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；
6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。

三、荧光素酶报告基因的优点

1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；
2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；
3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；
4、发光检测，检测方便；
5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；
6、检测范围广，大于7个数量级。

5. 如何使用多功能酶标仪检测双荧光素酶

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。
在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

6. 怎么使用多功能酶标仪检测双荧光素酶报告基因

以Promega公司双荧光素酶检测试剂盒为例：
1. 试剂准备
按照说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液。

2.仪器准备
准备单管或微孔板发光检测仪

3. 样品准备
按照说明书使用PLB细胞裂解液裂解细胞，取20ul细胞裂解液

4. 检测过程
a) 在1.5ml离心管中加入20ul细胞裂解液，然后加入100ul的LARII溶液，混合后放入发光检测仪检测第一次发光值；
b) 然后加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检测第二次发光值。

7. 双荧光素酶报告基因系统promega 多少钱

免疫沉淀 当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。 Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通 整个过程大致如下： 1. 创建miRNA模拟物。生物通 2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。 3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。 5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。 6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。 Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。 靶基因的验证 预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。 目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。 就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。

8. 双荧光素酶报告基因检测实验技术服务

1、  实验简介

Luciferase报告基因系统是以 荧光素(luciferin) 为底物来检测 萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)活性的实验。荧光素底物会在荧光素酶作用下会发光（波长540-600nm），且光强能反应荧光素酶的表达量。荧光素酶的蛋白表达量与启动子活性、mRNA的稳定性及翻译效率相关。从而将待测启动子、UTR等序列与荧光素酶ORF框融合表达，再检测其发光强度，就能判断这些序列对蛋白表达的影响

为了减少实验误差，同时转染一个能稳定表达的 肾荧光素酶 的质粒作为内参，催化 腔肠素 氧化产生蓝光（波长460-540nm）；所以叫双荧光素酶报告基因检测。

2 . 实验流程图

3 . 服务内容：双荧光素酶报告检测启动子活性服务主要分为以下两种：

a .   启动子活性分析，用于检测待测启动子是否有活性及其活性区域；

b .   启动子与转录因子结合验证，用于研究某转录因子是否调控某基因的待测启动子，以及它们的结合区域

项目 服务内容 结果交付 实验周期 客户提供

启动子活性分析 合成和构建2kb启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告30工作日1、细胞

2、基因信息

构建截短启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

细胞培养和双荧光素酶检测检测数据和实验报告

启动子与转录因子结合验证 合成和构建野生型启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告30工作日[if !supportLists]1、 [endif]细胞

[if !supportLists]2、 [endif]基因及转录因子信息

构建突变型启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

构建转录因子表达载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

细胞培养和双荧光素酶检测检测数据和实验报告

 

4. 送样要求

a.重组载体：

质粒不少于2ug，或甘油菌约100ul

b.细胞：

活细胞，2个T25瓶，细胞汇合度＞80%（广州市内）；或冻存细胞2管（广州外地区）

备注：载体或细胞可由如期代为构建或购买

 

5. 样本保存和运输要求：

a. 质粒或甘油菌可用冰袋保存运输；

b. 活细胞常温取样；

c. 冻存细胞干冰取样/运输：需要至少在送样前一天通知我方